2020年12月22日，臨研所、病理科和科研處邀請北京大學王愛民副教授做了題目為“新一代微型雙光子顯微成像系統(tǒng)介紹及其在臨床醫(yī)療診斷”的學術報告。學術報告由臨研所醫(yī)學實驗研究平臺潘琳老師主持。王愛民，北京大學信息科學技術學院副教授，畢業(yè)于北京大學物理系，獲學士、碩士學位，后于英國巴斯大學物理系獲博士學位。該研究組研發(fā)的微型雙光子顯微鏡，第1次在國際上獲得了小鼠大腦神經元和神經突觸清晰穩(wěn)定的動態(tài)信號，該成果獲得了2017年度“中國光學進展”和“中國科學進展”，并被NatureMethods評為2018年度“年度方法--無限制行為動物成像”。目前，該研究組正在研究新一代雙光子顯微成像技術在臨床診斷中的應用，為未來即時病理、離體組織檢測、術中診斷等提供新的影像手段和分析方法。雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器。國內ultimainvestigator雙光子顯微鏡的原理

TOPTICAFemtoFiberultra920超快光纖激光器是一種易于操作且無需維護的激光系統(tǒng)。其輸出波長為920nm，非常適合常規(guī)熒光基團（如GFP，eGFP，Eosin，GCaMP，CFP，Calcein或者Venus）的雙光子激發(fā)。能給熒光基團提供比較高的峰值功率，常用于神經科學和其他與激光有關的生物光子學學科。而且其獨特設計（制造簡單且經濟高效的光源）對雙光子熒光顯微鏡發(fā)展的革新具有潛在的可能。在雙光子顯微鏡中，峰值功率就是亮度！如果您希望獲得比較好的圖像亮度，那么你就需要短脈沖，高功率，較重要的是需要干凈的時間脈沖形狀。FemtoFiberultra920具有足夠高的輸出功率，較短的脈沖和獨特的Clean-Pulse技術，以及具有相對比較高的峰值功率，使得其在雙光子顯微鏡中可以實現****的亮度，而不會對樣品造成不必要的加熱。FemtoFiberultra920交鑰匙，完全集成的色散補償（可確保樣品處的脈沖較短），內置的功率控制，操作直觀以及其堅固而緊湊的設計，使該系統(tǒng)具有極為友好的用戶體驗，是非線性顯微鏡應用的較好解決方案。例如熒光蛋白的雙光子激發(fā)和基于SHG的對比機制。美國布魯克雙光子顯微鏡廠家雙光子顯微鏡是結合了雙光子技術和掃描共聚顯微鏡的一種新型熒光顯微鏡。

新一代微型化雙光子熒光顯微鏡體積小，重只2.2克，適于佩戴在小動物頭部顱窗上，實時記錄數十個神經元、上千個神經突觸的動態(tài)信號。在大型動物上，還可望實現多探頭佩戴、多顱窗不同腦區(qū)的長時程觀測。相比單光子激發(fā)，雙光子激發(fā)具有良好的光學斷層、更深的生物組織穿透等優(yōu)勢，其橫向分辨率達到0.65μm，成像質量與商品化大型臺式雙光子熒光顯微鏡可相媲美，遠優(yōu)于目前領域內主導的、美國腦科學計劃重要團隊所研發(fā)的微型化寬場顯微鏡。采用雙軸對稱高速微機電系統(tǒng)轉鏡掃描技術，成像幀頻已達40Hz（256*256像素），同時具備多區(qū)域隨機掃描和每秒1萬線的線掃描能力。此外，采用自主設計可傳導920nm飛秒激光的光子晶體光纖，該系統(tǒng)實現了微型雙光子顯微鏡對腦科學領域較廣泛應用的指示神經元活動的熒光探針（如GCaMP6）的有效利用。同時采用柔性光纖束進行熒光信號的接收，解決了動物的活動和行為由于熒光傳輸光纜拖拽而受到干擾的難題。未來，與光遺傳學技術的結合，可望在結構與功能成像的同時，精細地操控神經元和神經回路的活動。

雙光子熒光顯微鏡是激光掃描共聚焦顯微鏡和雙光子激發(fā)技術相結合的新技術。雙光子激發(fā)的基本原理是:在光子密度較高的情況下，熒光分子可以同時吸收兩個波長較長的光子，經過短暫的所謂激發(fā)態(tài)壽命后，發(fā)射一個波長較短的光子；效果和用波長為長波長一半的光子激發(fā)熒光分子是一樣的。雙(多)光子成像的優(yōu)點是具有更深的組織穿透深度，紅外光可以在平面上探測到極限為1mm的組織區(qū)域；因為信號背景比高，所以具有更高的對比度；由于激發(fā)體積小，具有定點激發(fā)、光毒性小的特點；激發(fā)波長由紫外、可見光調整為紅外激發(fā)，更加安全。由于其非侵入性和高分辨率的特點，雙光子顯微鏡成為了研究神經科學、ai癥研究、免疫學等領域的重要工具。

WinfriedDenk較初使用的光源是染料飛秒激光器(100fs脈寬、630nm可見光波長)。雖然染料激光器對于實驗室演示尚可，但是使用很不方便所以遠未實現商用。很快雙光子顯微鏡的標配光源就變成了飛秒鈦寶石激光器。除了固態(tài)光源優(yōu)勢，鈦寶石激光器還具有較寬的近紅外波長調諧范圍，而近紅外相比可見光穿透更深，對生物樣品損傷更小。下圖是Thorlabs的雙光子和三光子顯微鏡配置，鈦寶石飛秒可調諧激光器位于平臺較左邊。從雙光子到三光子科學家正在從雙光子轉向三光子顯微鏡。1996年，ChrisXu在康奈爾大學(Denk同導師實驗室)讀博期間發(fā)明了三光子顯微鏡，如果雙光子吸收可行，那么三光子看起來也是自然的發(fā)展方向。三光子成像使用更長的波長，大約在1.3和1.7微米，其成像深度也比雙光子更深，目前記錄約為2.2毫米，人類大腦皮層厚約4毫米。相比雙光子顯微鏡，三光子還要求以較低重頻使用更強和更短的激光脈沖，而傳統(tǒng)的鈦寶石激光器難以達到這些要求，但是對于摻鐿光纖飛秒光參量放大器則非常容易，比如我們的Y-Fi光參量放大器(OPA)。雙光子顯微鏡工作原理是利用兩個光子的能量相加達到熒光激發(fā)能量閾值，來激發(fā)樣品中熒光分子發(fā)出熒光信號。進口雙光子顯微鏡商家電話

雙光子顯微鏡使用長波長脈沖光，是通過物鏡匯聚的。國內ultimainvestigator雙光子顯微鏡的原理

雙光子顯微鏡為什么穿透能力強？因為組織對可見光區(qū)域的較強吸收和散射帶來兩個嚴重的問題第1個是激發(fā)光的減弱，第2個就是另外就是由于物鏡本身光的光學特性，單光子激發(fā)的背景較強，所以才有共聚焦系統(tǒng)提高成像的分辨率因為組織對可見光區(qū)域的較強吸收和散射帶來兩個嚴重的問題第1個是激發(fā)光的減弱，第2個就是另外就是由于物鏡本身光的光學特性，單光子激發(fā)的背景較強，所以才有共聚焦系統(tǒng)提高成像的分辨率剛好雙光子在這兩點具有很大的優(yōu)勢上面的內容基本在談到雙光子優(yōu)勢都會相對說明，在實際操作中成像的深度和樣品的關系很大，雙光子成像利用高亮度的熒光標記材料，已經有做到mm級別的穿透深度國內ultimainvestigator雙光子顯微鏡的原理