霍華德休斯頓醫(yī)學(xué)研究所（HHMI）ScottSternson課題組研究了影響這種源源不斷的食欲的神經(jīng)機(jī)制。他們通過(guò)使用Inscopix小顯微鏡觀察小鼠腦干區(qū)域的神經(jīng)元，發(fā)現(xiàn)貪念美食的小鼠可能是因?yàn)樘厥獾拇竽X區(qū)域?qū)γ朗澈湍滩璞绕渌∈蟾用舾小１灸軙?huì)驅(qū)使我們?cè)诟械金囸I和干渴的時(shí)候?qū)ふ沂澄?，在找到食物或水時(shí)通過(guò)眼睛看、鼻子聞、嘴巴嘗等方式來(lái)感受和決定要不要吃，吃到一定程度產(chǎn)生滿足感（或是吃了還想吃的不滿足感）。因此，要把大腦中匯集的關(guān)于吃喝的各類信號(hào)分清楚，并找出控制不同吃喝行為的神經(jīng)環(huán)路無(wú)疑是很有挑戰(zhàn)的任務(wù)。ScottSternson博士的研究團(tuán)隊(duì)在小鼠大腦中尋找饑餓和干渴神經(jīng)環(huán)路共存的腦區(qū)。他們注意到，腦干的藍(lán)斑區(qū)（locuscoeruleus）附近有一群谷氨酸能神經(jīng)元（被稱為periLC神經(jīng)元），參與進(jìn)食和飲水的行為，是餓和渴的匯聚點(diǎn)。為了研究這些神經(jīng)細(xì)胞的功能，研究小組開(kāi)發(fā)了一種技術(shù)，可以讓小鼠在自由活動(dòng)的同時(shí)，通過(guò)Inscopix自由活動(dòng)鈣成像顯微鏡觀察記錄腦干中periLC神經(jīng)元的活動(dòng)。這項(xiàng)研究的作者龔蓉博士表示，解決這個(gè)技術(shù)是此項(xiàng)研究的關(guān)鍵。鈣離子能產(chǎn)生許多控制細(xì)胞功能的胞內(nèi)信號(hào)，如突觸囊泡中神經(jīng)遞質(zhì)的釋放等。江蘇光遺傳鈣成像動(dòng)物行為學(xué)

細(xì)胞內(nèi)鈣離子作為重要的信號(hào)分子其作用具有時(shí)間性和空間性。當(dāng)個(gè)細(xì)胞興奮時(shí)，產(chǎn)生了一個(gè)電沖動(dòng)，此時(shí)，細(xì)胞外的鈣離子流入該細(xì)胞內(nèi)，促使該細(xì)胞分泌神經(jīng)遞質(zhì)，神經(jīng)遞質(zhì)與相鄰的下一級(jí)神經(jīng)細(xì)胞膜上的蛋白分子結(jié)合，促使這一級(jí)神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生新的電沖動(dòng)。以此類推，神經(jīng)信號(hào)便一級(jí)一級(jí)地傳遞下去，從而構(gòu)成復(fù)雜的信號(hào)體系，較終形成學(xué)習(xí)、記憶等大腦的高級(jí)功能。在哺乳動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)中，鈣離子同樣扮演著重要的信號(hào)分子的角色。靜息狀態(tài)下大部分神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度約為50-100nM，而細(xì)胞興奮時(shí)鈣離子濃度能瞬間上升10-100倍，增加的鈣離子對(duì)于突觸囊泡胞吐釋放神經(jīng)遞質(zhì)的過(guò)程必不可少。眾所周知，只有游離鈣才具有生物學(xué)活性，而細(xì)胞質(zhì)內(nèi)鈣離子濃度由鈣離子的內(nèi)外流平衡所決定，同時(shí)也受鈣結(jié)合蛋白的影響。細(xì)胞外鈣離子內(nèi)流的方式有很多種，其中包括電壓門(mén)控鈣離子通道、離子型谷氨酰胺受體、煙堿型膽堿能受體（nAChR）和瞬時(shí)受體電位C型通道（TRPC）等。神經(jīng)元鈣成像的原理就是利用特殊的熒光染料或鈣離子指示劑將神經(jīng)元中鈣離子濃度的變化通過(guò)熒光強(qiáng)度表現(xiàn)出來(lái)，以反映神經(jīng)元活性。該方法可以同時(shí)觀察多個(gè)功能或位置相關(guān)的腦細(xì)胞。美國(guó)熒光顯微鈣成像生產(chǎn)廠家近年來(lái)出現(xiàn)了通過(guò)植入性的顯微鏡或透鏡進(jìn)行活動(dòng)動(dòng)物鈣成像的技術(shù)。

靜息狀態(tài)下大部分神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度約為50-100nM，而細(xì)胞興奮時(shí)鈣離子濃度能瞬間上升10-100倍，增加的鈣離子對(duì)于突觸囊泡胞吐釋放神經(jīng)遞質(zhì)的過(guò)程必不可少。眾所周知，只有游離鈣才具有生物學(xué)活性，而細(xì)胞質(zhì)內(nèi)鈣離子濃度由鈣離子的內(nèi)外流平衡所決定，同時(shí)也受鈣結(jié)合蛋白的影響。細(xì)胞外鈣離子內(nèi)流的方式有很多種，其中包括電壓門(mén)控鈣離子通道、離子型谷氨酰胺受體、煙堿型膽堿能受體（nAChR）和瞬時(shí)受體電位C型通道（TRPC）等。神經(jīng)元鈣成像的原理就是利用特殊的熒光染料或鈣離子指示劑將神經(jīng)元中鈣離子濃度的變化通過(guò)熒光強(qiáng)度表現(xiàn)出來(lái)，以反映神經(jīng)元活性。該方法可以同時(shí)觀察多個(gè)功能或位置相關(guān)的腦細(xì)胞。

可見(jiàn)光激發(fā)Ca2+熒光探針：與紫外光激發(fā)探針相比，可見(jiàn)光激發(fā)Ca2+探針具有更強(qiáng)的染料吸收性能，對(duì)Ca2+變化水平檢測(cè)敏感度也更高，能夠降低對(duì)活細(xì)胞的光毒性和樣品自發(fā)熒光以及光散射的干擾，且無(wú)光譜偏移。較常使用的可見(jiàn)光激發(fā)Ca2+熒光探針有Fluo-3，F(xiàn)luo-4，Rhod-2等，同時(shí)他們也都是非比率型指示劑。Fluo-3是較常用的可見(jiàn)光激發(fā)Ca2+熒光指示劑之一，是典型的的單波長(zhǎng)指示劑，比較大激發(fā)波長(zhǎng)為506nm，比較大發(fā)射波長(zhǎng)為526nm。它與Ca2+結(jié)合之前幾乎無(wú)熒光，結(jié)合后熒光會(huì)增加60至100倍，從而避免了細(xì)胞自身的熒光干擾。實(shí)際檢測(cè)時(shí)推薦使用的激發(fā)波長(zhǎng)為488nm左右，發(fā)射波長(zhǎng)為525～530nm（圖3）。Fluo-3可以用在激光共聚焦顯微成像或流式細(xì)胞儀中。它還有一個(gè)升級(jí)版本Fluo-4，在相同Ca2+濃度下信號(hào)更強(qiáng)。鈣成像技術(shù)的不斷進(jìn)步，使得人們對(duì)神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域有了進(jìn)一步的拓展。

細(xì)胞內(nèi)鈣離子作為重要的信號(hào)分子其作用具有時(shí)間性和空間性。當(dāng)神經(jīng)細(xì)胞興奮時(shí)，會(huì)產(chǎn)生一個(gè)電沖動(dòng)，在此時(shí)，細(xì)胞外的鈣離子回流入該細(xì)胞內(nèi)，促使這個(gè)細(xì)胞分泌神經(jīng)遞質(zhì)，神經(jīng)遞質(zhì)與相鄰的下一級(jí)神經(jīng)細(xì)胞膜上的蛋白分子相結(jié)合，促使這個(gè)一級(jí)神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生新的電沖動(dòng)。以此類推，神經(jīng)信號(hào)便一級(jí)一級(jí)地傳遞下去，從而構(gòu)成復(fù)雜的信號(hào)體系，形成了學(xué)習(xí)、記憶等大腦的高級(jí)功能。在哺乳動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)中，鈣離子同樣扮演著重要的信號(hào)分子的角色。傳統(tǒng)的鈣成像技術(shù)受限于顯微鏡的視野，只能對(duì)很小的一片區(qū)域進(jìn)行記錄。美國(guó)熒光鈣成像inscopix

現(xiàn)在鈣成像技術(shù)使用的鈣離子指示劑主要有化學(xué)性鈣離子指示劑和基因編碼鈣離子指示劑。江蘇光遺傳鈣成像動(dòng)物行為學(xué)

鈣離子成像系統(tǒng)：傳統(tǒng)的寬場(chǎng)熒光顯微鏡由于光散射的影響，只能夠?qū)Υ竽X淺層的神經(jīng)元或在離體組織上進(jìn)行成像，共聚焦顯微鏡由于光損傷較大，一般也只用于離體鈣成像。隨著熒光顯微鏡技術(shù)的迅速發(fā)展，在體鈣成像技術(shù)得到了蓬勃發(fā)展。雙光子熒光顯微鏡能夠在進(jìn)行成像的時(shí)候?qū)崿F(xiàn)高分辨率和高信噪比。例如，用雙光子顯微鏡對(duì)海馬樹(shù)突棘的鈣離子信號(hào)進(jìn)行成像，研究神經(jīng)元突觸后長(zhǎng)時(shí)程控制(Wangetal.,2000)；觀察小鼠運(yùn)動(dòng)皮層神經(jīng)元在嗅覺(jué)選擇任務(wù)中刺激相關(guān)電位(Komiyamaetal.,2010)等等。不過(guò)，這些實(shí)驗(yàn)還是需要對(duì)動(dòng)物進(jìn)行麻醉和固定，而神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域很多研究更希望能夠?qū)ψ杂苫顒?dòng)的動(dòng)物進(jìn)行研究。近年來(lái)出現(xiàn)了通過(guò)植入性的microscope或microlens進(jìn)行freelymoving動(dòng)物鈣成像的技術(shù)。如圖6中所示的光纖成像法：使用一端帶有GRINlens的光纖連接顯微鏡和動(dòng)物大腦，從特定腦區(qū)發(fā)出的熒光信號(hào)被光纖收集，然后通過(guò)相機(jī)成像。動(dòng)物頭部只需植入GRINlens，方便活動(dòng)，而且可以同時(shí)植入多個(gè)lens來(lái)觀察不同的腦區(qū)之間的聯(lián)系和相互作用。不過(guò)這種成像方法的視野較小，分辨率也比較差。江蘇光遺傳鈣成像動(dòng)物行為學(xué)