王愛(ài)民副教授結(jié)合工作實(shí)例，展示了雙光子顯微鏡的研發(fā)與應(yīng)用。歷經(jīng)3年多的協(xié)同奮戰(zhàn)，成功研制新一代高速分辨微型化雙光子熒光顯微鏡，重量只為2.2克，這一微型顯微鏡獲取了小鼠在自由行為過(guò)程中大腦神經(jīng)元和神經(jīng)突觸活動(dòng)清晰、穩(wěn)定的圖像，該顯微鏡適于佩戴在小動(dòng)物頭部，可實(shí)時(shí)記錄數(shù)十個(gè)神經(jīng)元、上千個(gè)神經(jīng)突觸的動(dòng)態(tài)信號(hào)，在大型動(dòng)物上，還可望實(shí)現(xiàn)多探頭佩戴、多顱窗不同腦區(qū)的長(zhǎng)時(shí)程觀測(cè)。雙光子顯微成像的在生物醫(yī)學(xué)研究和醫(yī)療領(lǐng)域應(yīng)用有較大的應(yīng)用前景，首先雙光子顯微鏡能夠進(jìn)行細(xì)胞和組織結(jié)構(gòu)成像，在亞微米級(jí)成像，此功能與目前市場(chǎng)上的共聚焦類(lèi)顯微鏡性能類(lèi)似；雙光子顯微成像能夠?qū)崟r(shí)、在體、原位、無(wú)創(chuàng)地，根據(jù)不同物質(zhì)組份的光譜特性，區(qū)分成像；雙光子顯微鏡能夠進(jìn)行生化指標(biāo)成像，在無(wú)造影劑的前提下，利用自發(fā)熒光、二次諧波、熒光獲得活細(xì)胞生化信息。優(yōu)勢(shì)來(lái)源于其雙光子光源的非線性光學(xué)效應(yīng)。進(jìn)口investigator雙光子顯微鏡廠家
實(shí)驗(yàn)從理論和實(shí)驗(yàn)上評(píng)估了多焦點(diǎn)v2PE顯微鏡的空間分辨率，并與單光子熒光顯微鏡進(jìn)行了對(duì)比，實(shí)驗(yàn)中v2PE的激發(fā)波長(zhǎng)為521 nm，使用放大倍率為100倍的物鏡，尺寸為0.6AU，對(duì)直徑100nm的熒光顆粒進(jìn)行了測(cè)試性成像，共獲得40幅不同采樣深度的圖像合成為三維圖像。圖像在橫向和縱向的半高全寬分別是177 nm和297 nm，這些值接近顯微鏡的理論分辨率。后續(xù)還利用軟件模擬從理論上研究了多焦點(diǎn)v2PE顯微技術(shù)的空間分辨率，模擬計(jì)算顯示v2PE點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)(PSF)的橫向半高寬與單光子激發(fā)熒光(1PE)相似，軸向的半高寬較1PE減少，可以提高空間分辨率。國(guó)內(nèi)布魯克雙光子顯微鏡用途雙光子顯微鏡品牌有哪些？
雙光子顯微鏡的基本原理是：在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時(shí)吸收 2 個(gè)長(zhǎng)波長(zhǎng)的光子，在經(jīng)過(guò)一個(gè)很短的所謂激發(fā)態(tài)壽命的時(shí)間后，發(fā)射出一個(gè)波長(zhǎng)較短的光子；其效果和使用一個(gè)波長(zhǎng)為長(zhǎng)波長(zhǎng)一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的。雙光子激發(fā)需要很高的光子密度，為了不損傷細(xì)胞，雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器。這種激光器發(fā)出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，其脈沖寬度只有 100 飛秒，而其周期可以達(dá)到 80至100兆赫茲。在使用高數(shù)值孔徑的物鏡將脈沖激光的光子聚焦時(shí)，物鏡的焦點(diǎn)處的光子密度是比較高的，雙光子激發(fā)只發(fā)生在物鏡的焦點(diǎn)上，所以雙光子顯微鏡不需要共聚焦***，提高了熒光檢測(cè)效率。
而配合了雙光子激發(fā)技術(shù)，激光共聚掃描顯微鏡則能更好得發(fā)揮功效。那么，什么是雙光子激發(fā)技術(shù)呢？在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時(shí)吸收2個(gè)長(zhǎng)波長(zhǎng)的光子使電子躍遷到較高能級(jí)，經(jīng)過(guò)一個(gè)很短的時(shí)間后，電子再躍遷回低能級(jí)同時(shí)放出一個(gè)波長(zhǎng)為長(zhǎng)波長(zhǎng)一半的光子（P=h/λ）。利用這個(gè)原理，便誕生了雙光子激發(fā)技術(shù)。雙光子顯微鏡使用長(zhǎng)波長(zhǎng)脈沖激光，通過(guò)物鏡匯聚，由于雙光子激發(fā)需要很高的光子密度，而物鏡焦點(diǎn)處的光子密度是比較高的，所以只有在焦點(diǎn)處才能發(fā)生雙光子激發(fā)，產(chǎn)生熒光，該點(diǎn)產(chǎn)生的熒光再穿過(guò)物鏡，被光探頭接收，從而達(dá)到逐點(diǎn)掃描的效果。在深度組織中以較長(zhǎng)時(shí)間對(duì)細(xì)胞成像，雙光子顯微鏡是當(dāng)前之選。
新一代微型化雙光子熒光顯微鏡體積小，重只2.2克，適于佩戴在小動(dòng)物頭部顱窗上，實(shí)時(shí)記錄數(shù)十個(gè)神經(jīng)元、上千個(gè)神經(jīng)突觸的動(dòng)態(tài)信號(hào)。在大型動(dòng)物上，還可望實(shí)現(xiàn)多探頭佩戴、多顱窗不同腦區(qū)的長(zhǎng)時(shí)程觀測(cè)。相比單光子激發(fā)，雙光子激發(fā)具有良好的光學(xué)斷層、更深的生物組織穿透等優(yōu)勢(shì)，其橫向分辨率達(dá)到0.65μm，成像質(zhì)量與商品化大型臺(tái)式雙光子熒光顯微鏡可相媲美，遠(yuǎn)優(yōu)于目前領(lǐng)域內(nèi)主導(dǎo)的、美國(guó)腦科學(xué)計(jì)劃重要團(tuán)隊(duì)所研發(fā)的微型化寬場(chǎng)顯微鏡。采用雙軸對(duì)稱高速微機(jī)電系統(tǒng)轉(zhuǎn)鏡掃描技術(shù)，成像幀頻已達(dá)40Hz（256*256像素），同時(shí)具備多區(qū)域隨機(jī)掃描和每秒1萬(wàn)線的線掃描能力。此外，采用自主設(shè)計(jì)可傳導(dǎo)920nm飛秒激光的光子晶體光纖，該系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了微型雙光子顯微鏡對(duì)腦科學(xué)領(lǐng)域較廣泛應(yīng)用的指示神經(jīng)元活動(dòng)的熒光探針（如GCaMP6）的有效利用。 同時(shí)采用柔性光纖束進(jìn)行熒光信號(hào)的接收，解決了動(dòng)物的活動(dòng)和行為由于熒光傳輸光纜拖拽而受到干擾的難題。未來(lái)，與光遺傳學(xué)技術(shù)的結(jié)合，可望在結(jié)構(gòu)與功能成像的同時(shí)，精細(xì)地操控神經(jīng)元和神經(jīng)回路的活動(dòng)。雙光子顯微鏡廠家就找因斯蔻浦(上海)生物科技有限公司；進(jìn)口investigator雙光子顯微鏡廠家
雙光子顯微鏡使用的是高能量鎖模脈沖器。進(jìn)口investigator雙光子顯微鏡廠家
2008年錢(qián)永健等人由于熒光蛋白（GFP，綠色熒光蛋白）的發(fā)現(xiàn)和使用，獲得了諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)，是對(duì)熒光成像技術(shù)的一次巨大肯定和推動(dòng)。光學(xué)成像本身具有高分辨率、高通量、非侵入和非毒性等特點(diǎn)，再與熒光蛋白以及熒光染料等標(biāo)記物在細(xì)胞中的定位與表達(dá)技術(shù)相結(jié)合，使得科學(xué)家可以特異性的分辨生物體乃至細(xì)胞內(nèi)部不同結(jié)構(gòu)與成分，并且能夠在生命體和細(xì)胞仍具有活性的狀態(tài)下（狀態(tài)）對(duì)其功能進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察。這就使得熒光成像技術(shù)成為了無(wú)可替代的，生物學(xué)家現(xiàn)今較為重要的技術(shù)手段之一。目前，大多數(shù)細(xì)胞生物學(xué)和生理學(xué)研究主要還是在離體培養(yǎng)的細(xì)胞體系中研究。然而與細(xì)胞生物學(xué)研究有所不同的是，大腦的功能研究的整體性和原位性顯得更加關(guān)鍵：只研究分離的神經(jīng)元無(wú)法解釋神經(jīng)系統(tǒng)的功能和規(guī)律。由于被觀測(cè)的信號(hào)會(huì)受到樣本組織的散射和吸收，根本無(wú)法穿透如此深的組織進(jìn)行成像。而雙光子顯微鏡（Two-photonMicroscopy，簡(jiǎn)稱TPM）的發(fā)明，則為此類(lèi)研究帶來(lái)了希望。雙光子顯微鏡特有的非線性光學(xué)特性，再加上其工作波長(zhǎng)處在紅外區(qū)域等特點(diǎn)，令其在生物體組織內(nèi)的穿透深度較大提高，使得雙光子顯微鏡成為神經(jīng)科學(xué)家進(jìn)行神經(jīng)成像較理想的工具。進(jìn)口investigator雙光子顯微鏡廠家
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