基于多光子顯微鏡的神經(jīng)成像技術(shù)原理：多光子顯微鏡可用于深度成像和三維成像，因此可用于拍攝不透明的厚樣品。目前主要使用的多光子顯微鏡包括雙光子顯微鏡和三光子顯微鏡。雙光子顯微鏡的結(jié)構(gòu)與共焦類(lèi)似，區(qū)別在于：1)雙光子顯微鏡的激發(fā)光波長(zhǎng)比共焦長(zhǎng)，能量較低，但穿透能力較強(qiáng)；2)雙光子顯微鏡沒(méi)有小孔，提高了檢測(cè)效率；3)雙光子顯微鏡成像深度較快提高。那么，為什么雙光子能具有共焦顯微鏡所沒(méi)有的優(yōu)勢(shì)呢？原因是它采用雙光子激發(fā)方式。使用波長(zhǎng)較長(zhǎng)的激發(fā)光子，光子的能量較低，因此電子需要吸收兩個(gè)這樣的激發(fā)光子才能達(dá)到激發(fā)態(tài)，從而釋放出一個(gè)熒光光子。因此，熒光信號(hào)的強(qiáng)度與光強(qiáng)的平方成正比。因?yàn)榻裹c(diǎn)處的光強(qiáng)較大，只能在焦點(diǎn)處激發(fā)熒光。波長(zhǎng)越長(zhǎng)，穿透力越強(qiáng)，因此雙光子顯微鏡的成像深度大于共焦顯微鏡。由于兩個(gè)光子只在焦點(diǎn)激發(fā)熒光，不需要小孔，而是將所有的熒光都收集起來(lái)，提高了檢測(cè)效率。三光子顯微鏡的原理類(lèi)似于雙光子顯微鏡，利用三個(gè)激發(fā)光子可以實(shí)現(xiàn)更深的成像深度。由于使用了更長(zhǎng)的激發(fā)波長(zhǎng)，穿透能力更強(qiáng)，成像深度更大。此外，由于較強(qiáng)的非線性效應(yīng)，熒光信號(hào)的強(qiáng)度與光強(qiáng)的立方成正比，因此比雙光子具有更低的非聚焦激發(fā)和背景噪聲。多光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器。美國(guó)飛秒激光多光子顯微鏡研究

國(guó)內(nèi)顯微鏡制造市場(chǎng)目前斷層嚴(yán)重。目前我國(guó)顯微鏡行業(yè)發(fā)展缺乏技術(shù)沉淀，20年以上經(jīng)營(yíng)積累的企業(yè)十分稀缺，深度精密制造、光學(xué)主要部件設(shè)計(jì)及工藝嚴(yán)重制約產(chǎn)業(yè)升級(jí)。目前中國(guó)顯微鏡中如多光子顯微鏡、共聚焦掃描和電子顯微鏡等主要集中在徠卡顯微系統(tǒng)、蔡司、尼康、奧林巴斯等國(guó)外企業(yè)。國(guó)內(nèi)具備生產(chǎn)顯微鏡能力的企業(yè)屈指可數(shù)，若國(guó)內(nèi)顯微鏡企業(yè)能打破技術(shù)壁壘，切入顯微鏡市場(chǎng)，企業(yè)的生產(chǎn)經(jīng)營(yíng)將騰躍至一個(gè)更高的格局。未來(lái)國(guó)產(chǎn)多光子激光掃描顯微鏡替代空間大。目前中國(guó)使用的多光子激光掃描顯微鏡幾乎被徠卡顯微系統(tǒng)、蔡司、尼康和奧林巴斯壟斷。國(guó)內(nèi)有能力開(kāi)始生產(chǎn)多光子激光掃描顯微鏡的企業(yè)極少，若國(guó)內(nèi)能夠制造出高性能、高可靠性的多光子激光掃描顯微鏡，無(wú)異是會(huì)面臨極大的市場(chǎng)機(jī)遇。美國(guó)在體多光子顯微鏡設(shè)備多光子顯微鏡適用于動(dòng)物大腦皮層深層（400微米）細(xì)胞的形態(tài)、生理學(xué)研究。

根據(jù)阿貝成像原理，許多光學(xué)成像系統(tǒng)是一個(gè)低通濾波器，物平面包含從低頻到高頻的信息，透鏡口徑會(huì)限制高頻信息通過(guò)，只允許一定的低頻通過(guò)，因此丟失了高頻信息會(huì)使成像所得圖像的細(xì)節(jié)變模糊，降低分辨率。對(duì)于三維成像來(lái)說(shuō)，寬場(chǎng)照明時(shí)得到的信息不僅包含物鏡焦平面上樣品的部分信息，同時(shí)還包含焦平面外的樣品信息。由于受到焦平面外的信息干擾，常規(guī)熒光顯微鏡無(wú)法獲得層析圖像。三維結(jié)構(gòu)光照明顯微鏡能夠提高分辨率、獲得層析圖像，是因?yàn)槔锰囟ńY(jié)構(gòu)的照明光能引入樣品的高頻信息，當(dāng)結(jié)構(gòu)光的空間頻率足夠高時(shí)，只有靠近焦面的部分才能被結(jié)構(gòu)光調(diào)制，超出這一區(qū)域，逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榫鶆蛘彰?，也就是只有焦面附近的有限區(qū)域具有相對(duì)完整的頻譜信息，離焦后，高頻信息迅速衰減，所以使用高頻結(jié)構(gòu)光照明可以區(qū)分焦面和離焦區(qū)域來(lái)獲得層析圖像。然后再通過(guò)軸向掃描可以獲取樣品不同深度的焦面圖像，重建樣品的三維結(jié)構(gòu)。

有許多方法可以實(shí)現(xiàn)快速光柵掃描，例如使用振鏡進(jìn)行快速2D掃描，以及將振鏡與可調(diào)電動(dòng)透鏡相結(jié)合進(jìn)行快速3D掃描。而可調(diào)電動(dòng)式鏡頭由于機(jī)械慣性的限制，無(wú)法在軸向快速切換焦點(diǎn)，影響成像速度?，F(xiàn)在它可以被空間光調(diào)制器(SLM)取代。遠(yuǎn)程對(duì)焦也是實(shí)現(xiàn)3D成像的一種手段，如圖2所示。LSU模塊中，掃描振鏡水平掃描，ASU模塊包括物鏡L1和反射鏡M，通過(guò)調(diào)整M的位置實(shí)現(xiàn)軸向掃描該技術(shù)不僅可以校正主物鏡L2引入的光學(xué)像差，還可以進(jìn)行快速軸向掃描。為了獲得更多的神經(jīng)元成像，可以通過(guò)調(diào)整顯微鏡的物鏡設(shè)計(jì)來(lái)放大FOV。然而，大NA和大FOV的物鏡通常很重，不能快速移動(dòng)以進(jìn)行快速軸向掃描，因此大FOV系統(tǒng)依賴(lài)于遠(yuǎn)程聚焦、SLM和可調(diào)電動(dòng)透鏡。光子顯微成像技術(shù)不是什么新技術(shù)，早在20多年前就有了，目前已經(jīng)在生命科學(xué)和材料科學(xué)中廣泛應(yīng)用。

與傳統(tǒng)的單光子寬視野熒光顯微鏡相比，多光子顯微鏡（MPM）具有光學(xué)切片和深層成像等功能，這兩個(gè)優(yōu)勢(shì)極大地促進(jìn)了研究者們對(duì)于完整大腦深處神經(jīng)的了解與認(rèn)識(shí)。2019年，JeromeLecoq等人從大腦深處的神經(jīng)元成像、大量神經(jīng)元成像、高速神經(jīng)元成像這三個(gè)方面論述了相關(guān)的MPM技術(shù)[1]。想要將神經(jīng)元活動(dòng)與復(fù)雜行為聯(lián)系起來(lái)，通常需要對(duì)大腦皮質(zhì)深層的神經(jīng)元進(jìn)行成像，這就要求MPM具有深層成像的能力。激發(fā)和發(fā)射光會(huì)被生物組織高度散射和吸收是限制MPM成像深度的主要因素，雖然可以通過(guò)增加激光強(qiáng)度來(lái)解決散射問(wèn)題，但這會(huì)帶來(lái)其他問(wèn)題，例如燒壞樣品、離焦和近表面熒光激發(fā)。增加MPM成像深度比較好的方法是用更長(zhǎng)的波長(zhǎng)作為激發(fā)光。多光子顯微鏡是一款針對(duì)厚樣本進(jìn)行深層成像的利器,特別是在實(shí)驗(yàn)中。全自動(dòng)多光子顯微鏡長(zhǎng)時(shí)間觀察

生產(chǎn)和消費(fèi)的角度分析多光子顯微鏡的主要生產(chǎn)地區(qū)、主要消費(fèi)地區(qū)以及主要的生產(chǎn)商。美國(guó)飛秒激光多光子顯微鏡研究

通過(guò)添加FACED模塊，可以將基于標(biāo)準(zhǔn)振鏡的現(xiàn)有2PM輕松轉(zhuǎn)換為千赫茲成像系統(tǒng)。FACED雙光子熒光顯微鏡遵循光柵掃描，需要很少的計(jì)算處理，在稀疏或密集的標(biāo)記樣本中均可以使用，并且不受串?dāng)_的影響，而且對(duì)整個(gè)圖像平面采樣后可以進(jìn)行運(yùn)動(dòng)校正。實(shí)驗(yàn)中沒(méi)有觀察到光損傷的跡象，此外，子脈沖延遲到達(dá)相同的樣品位置，能為熒光團(tuán)提供充足的時(shí)間使其從易于破壞的暗態(tài)返回到基態(tài)，可以明顯減少光漂白。使用現(xiàn)有的傳感器，F(xiàn)ACED雙光子熒光顯微鏡可以提供足夠的速度和靈敏度來(lái)檢測(cè)神經(jīng)元過(guò)程中的鈣瞬變和谷氨酸瞬變，以及來(lái)自細(xì)胞體的尖峰和亞閾值電壓。該組使用基于FACED的2PM顯微鏡，在小鼠大腦中實(shí)現(xiàn)了千赫茲速率的神經(jīng)活動(dòng)成像。在物鏡平均激光功率為10-85mW下，他們測(cè)量了清醒小鼠中V1神經(jīng)元的自發(fā)性和感覺(jué)誘發(fā)性的超閾值和亞閾值電位活動(dòng)。美國(guó)飛秒激光多光子顯微鏡研究