通過并行化不同激光波長的激光掃描，研究人員增加了在相同時(shí)間內(nèi)可以成像的體積，同時(shí)保持了高的時(shí)間和空間分辨率。研究人員通過引入兩種不同波長的鈣信號(hào)熒光探針，將神經(jīng)元群體的活動(dòng)標(biāo)記為兩種不同的顏色，同時(shí)激發(fā)兩種不同波長的探針，從而實(shí)現(xiàn)了兩種顏色的并行數(shù)據(jù)記錄。為了實(shí)現(xiàn)三維空間成像，研究人員還在兩個(gè)激光束上配置了快速變焦系統(tǒng)，即一個(gè)電透鏡和一個(gè)空間光調(diào)制器。因此，可以以10Hz的速度同時(shí)記錄10個(gè)500微米和500微米的平面，覆蓋600微米的深度，覆蓋大腦皮層第二層到第五層的結(jié)構(gòu)，體積內(nèi)可以記錄2000多個(gè)神經(jīng)元。雙光子顯微鏡只有焦平面處才能形成雙光子吸收，而焦平面之外由于光強(qiáng)低無法被發(fā)動(dòng)，所以雙光子成像更清晰。國外2PPLUS雙光子顯微鏡授權(quán)商
實(shí)驗(yàn)從理論和實(shí)驗(yàn)上評估了多焦點(diǎn)v2PE顯微鏡的空間分辨率，并與單光子熒光顯微鏡進(jìn)行了對比，實(shí)驗(yàn)中v2PE的激發(fā)波長為521nm，使用放大倍率為100倍的物鏡，尺寸為0.6AU，對直徑100nm的熒光顆粒進(jìn)行了測試性成像，共獲得40幅不同采樣深度的圖像合成為三維圖像。圖像在橫向和縱向的半高全寬分別是177nm和297nm，這些值接近顯微鏡的理論分辨率。后續(xù)還利用軟件模擬從理論上研究了多焦點(diǎn)v2PE顯微技術(shù)的空間分辨率，模擬計(jì)算顯示v2PE點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)(PSF)的橫向半高寬與單光子激發(fā)熒光(1PE)相似，軸向的半高寬較1PE減少，可以提高空間分辨率。熒光雙光子顯微鏡成像視野是多少雙光子顯微鏡將得到更大的發(fā)展與更廣的應(yīng)用。
雙光子熒光顯微鏡是結(jié)合了激光掃描共聚焦顯微鏡和雙光子激發(fā)技術(shù)的一種新技術(shù)。雙光子激發(fā)的基本原理是：在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時(shí)吸收2個(gè)長波長的光子，在經(jīng)過一個(gè)很短的所謂激發(fā)態(tài)壽命的時(shí)間后，發(fā)射出一個(gè)波長較短的光子；其效果和使用一個(gè)波長為長波長一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的。雙（多）光子成像優(yōu)勢在于，具有更深的組織穿透深度，利用紅外光，能夠在層面檢測極限達(dá)1mm的組織區(qū)域；因信號(hào)背景比高，而具有更高的對比度；因激發(fā)體積小，具有定點(diǎn)激發(fā)的特性，具有更少的光毒性；激發(fā)波長由紫外、可見光調(diào)整為紅外激發(fā)，能夠更加安全。
WinfriedDenk較初使用的光源是染料飛秒激光器(100fs脈寬、630nm可見光波長)。雖然染料激光器對于實(shí)驗(yàn)室演示尚可，但是使用很不方便所以遠(yuǎn)未實(shí)現(xiàn)商用。很快雙光子顯微鏡的標(biāo)配光源就變成了飛秒鈦寶石激光器。除了固態(tài)光源優(yōu)勢，鈦寶石激光器還具有較寬的近紅外波長調(diào)諧范圍，而近紅外相比可見光穿透更深，對生物樣品損傷更小。下圖是Thorlabs的雙光子和三光子顯微鏡配置，鈦寶石飛秒可調(diào)諧激光器位于平臺(tái)較左邊?？茖W(xué)家正在從雙光子轉(zhuǎn)向三光子顯微鏡。1996年，ChrisXu在康奈爾大學(xué)(Denk同導(dǎo)師實(shí)驗(yàn)室)讀博期間發(fā)明了三光子顯微鏡，如果雙光子吸收可行，那么三光子看起來也是自然的發(fā)展方向。三光子成像使用更長的波長，大約在1.3和1.7微米，其成像深度也比雙光子更深，目前記錄約為2.2毫米，人類大腦皮層厚約4毫米。相比雙光子顯微鏡，三光子還要求以較低重頻使用更強(qiáng)和更短的激光脈沖，而傳統(tǒng)的鈦寶石激光器難以達(dá)到這些要求，但是對于摻鐿光纖飛秒光參量放大器則非常容易，比如我們的Y-Fi光參量放大器(OPA)。雙光子顯微鏡供應(yīng)商找因斯蔻浦(上海)生物科技有限公司。
隨著技術(shù)的發(fā)展，雙光子顯微鏡的性能得到不斷地優(yōu)化，結(jié)合它的特點(diǎn)，大致可以分成深和活兩個(gè)方面的提升。要想讓激發(fā)激光進(jìn)入更深的層面，大致可從兩個(gè)方面入手，裝置優(yōu)化與標(biāo)本改造。關(guān)于裝置優(yōu)化，我們可以把激光束變得更細(xì)，使能量更加集中，就能讓激光穿透更深。關(guān)于標(biāo)本，其中影響光傳播的主要是物質(zhì)吸收和散射，解決這個(gè)問題，我們需要對樣本進(jìn)行透明化處理。一種方法是運(yùn)用某種物質(zhì)將標(biāo)本浸泡，使其中的物質(zhì)（主要是脂質(zhì)）被破壞或溶解。另一種方法是運(yùn)用電泳將脂質(zhì)電解，讓標(biāo)本的“透明度”提高。雙光子顯微鏡還可以對一些具有特性的染料細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，還有一些短波長可以利用雙光子特性進(jìn)行特定實(shí)驗(yàn)。國外bruker雙光子顯微鏡熒光壽命計(jì)數(shù)
雙光子顯微鏡大量運(yùn)營在實(shí)驗(yàn)室當(dāng)中；國外2PPLUS雙光子顯微鏡授權(quán)商
雙光子顯微鏡是結(jié)合了雙光子激發(fā)技術(shù)和激光掃描共聚顯微鏡的一種新型熒光顯微鏡，其原理大致是這樣的：首先，讓我們來看看什么是熒光顯微鏡。熒光顯微鏡是以紫外線為光源，照射被檢物體上的熒光物質(zhì)或是熒光染料，使其發(fā)出熒光。相比普通光學(xué)顯微鏡，熒光顯微鏡運(yùn)用了波長更短的紫外線，再將可見光過濾掉，提高了分辨力率。而當(dāng)被檢物體過厚時(shí)，從不同深度發(fā)出的熒光都會(huì)打在物鏡上，使觀察到的像模糊、發(fā)虛，無法清楚的知道被檢物體的結(jié)構(gòu)。而激光掃描共聚顯微鏡就是在熒光顯微鏡的基礎(chǔ)上，增加了激光掃描裝置，從而解決了上述問題。激光共聚掃描顯微鏡脫離了傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡的場光源和局部平面成像模式，采用激光束作光源，激光束經(jīng)照明孔，經(jīng)由分光鏡反射至物鏡，并聚焦于樣品上，對標(biāo)本焦平面上每一點(diǎn)進(jìn)行掃描。組織樣品中的熒光物質(zhì)受到刺激后發(fā)出的熒光經(jīng)原來入射光路直接反向回到分光鏡，通過探測孔時(shí)先聚焦，然后被光探頭收集，轉(zhuǎn)化為信號(hào)輸送到計(jì)算機(jī)進(jìn)行處理。這個(gè)裝置能讓通過探測***的只有焦平面上發(fā)出的熒光，使成像更為清晰準(zhǔn)確，同時(shí)通過改變物鏡的焦距，能對不同焦平面進(jìn)行掃描，通過計(jì)算機(jī)繪出普通顯微鏡無法觀測的三維圖像。國外2PPLUS雙光子顯微鏡授權(quán)商
