雙光子顯微鏡的優(yōu)勢：在深度組織中以較長時(shí)間對活細(xì)胞成像，雙光子顯微鏡是當(dāng)前之選。雙光子和共聚焦顯微鏡都是通過激光激發(fā)樣品中的熒光標(biāo)記，使用探測器測量被激發(fā)的熒光。但是，共聚焦一般使用單模光纖耦合激光器，通過單光子激發(fā)熒光，而雙光子使用飛秒激光器，通過幾乎同時(shí)吸收兩個(gè)長波光子激發(fā)熒光。下面是兩種技術(shù)的對比圖。雙光子激發(fā)熒光的主要優(yōu)勢：雙光子比共聚焦使用的更長的波長，所以對組織的損傷更小且穿透更深。共聚焦的成像深度一般為100微米，雙光子則能達(dá)到250到500微米，甚至超過1毫米。另外，同時(shí)吸收兩個(gè)光子意味只有度聚焦點(diǎn)處能被激發(fā)，所以不會(huì)損傷焦平面之外的組織，并且生成更清晰的圖像。雙光子顯微鏡有哪些分類呢？美國ultima雙光子顯微鏡應(yīng)用是什么

雙光子顯微鏡的優(yōu)勢相比普通的顯微鏡電子顯微鏡可以觀察尺度更小的東西，冷凍電鏡更是可以觀察有活性的生物大分子，而雙光子顯微鏡有什么優(yōu)勢呢？它能做到什么普通光學(xué)顯微鏡做不到的事情嗎？原來，雙光子顯微鏡可以精確穿透較厚標(biāo)本進(jìn)行定點(diǎn)、觀察！由于電磁波的波長越短，粒子性越強(qiáng)，受散射影響也就越大。雙光子顯微鏡將激發(fā)光源改為長波長激光，在增加了激光的穿透性的同時(shí)還減少了對細(xì)胞的毒性。除此之外，因?yàn)橹挥形镧R焦點(diǎn)處能發(fā)生雙光子激發(fā)效應(yīng)，所以掃描的精確度極高，也能提高激發(fā)光效率，減少被掃描點(diǎn)之外的熒光物質(zhì)消耗。國外熒光雙光子顯微鏡原理雙光子顯微鏡在各領(lǐng)域研究中已有許多成功實(shí)例。

配合雙光子激發(fā)技術(shù)，激光共聚掃描顯微鏡則能更好得發(fā)揮功效。那么，什么是雙光子激發(fā)技術(shù)呢？在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時(shí)吸收2個(gè)長波長的光子使電子躍遷到較高能級，經(jīng)過一個(gè)很短的時(shí)間后，電子再躍遷回低能級同時(shí)放出一個(gè)波長為長波長一半的光子（P=h/λ）。利用這個(gè)原理，便誕生了雙光子激發(fā)技術(shù)。雙光子顯微鏡使用長波長脈沖激光，通過物鏡匯聚，由于雙光子激發(fā)需要很高的光子密度，而物鏡焦點(diǎn)處的光子密度是比較高的，所以只有在焦點(diǎn)處才能發(fā)生雙光子激發(fā)，產(chǎn)生熒光，該點(diǎn)產(chǎn)生的熒光再次穿過物鏡，被光探頭接收，從而達(dá)到逐點(diǎn)掃描的效果。

通過并行化不同激光波長的激光掃描，研究人員增加了在相同時(shí)間內(nèi)可以成像的體積，同時(shí)保持了高的時(shí)間和空間分辨率。研究人員通過引入兩種不同波長的鈣信號熒光探針，將神經(jīng)元群體的活動(dòng)標(biāo)記為兩種不同的顏色，同時(shí)激發(fā)兩種不同波長的探針，從而實(shí)現(xiàn)了兩種顏色的并行數(shù)據(jù)記錄。為了實(shí)現(xiàn)三維空間成像，研究人員還在兩個(gè)激光束上配置了快速變焦系統(tǒng)，即一個(gè)電透鏡和一個(gè)空間光調(diào)制器。因此，可以以10Hz的速度同時(shí)記錄10個(gè)500微米和500微米的平面，覆蓋600微米的深度，覆蓋大腦皮層第二層到第五層的結(jié)構(gòu)，體積內(nèi)可以記錄2000多個(gè)神經(jīng)元。雙光子顯微鏡可以進(jìn)行厚的組織樣品拍攝。

配合雙光子激發(fā)技術(shù)，激光共聚掃描顯微鏡則能更好得發(fā)揮功效。那么，什么是雙光子激發(fā)技術(shù)呢？在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時(shí)吸收2個(gè)長波長的光子使電子躍遷到較高能級，經(jīng)過一個(gè)很短的時(shí)間后，電子再躍遷回低能級同時(shí)放出一個(gè)波長為長波長一半的光子（P=h/λ）。利用這個(gè)原理，便誕生了雙光子激發(fā)技術(shù)。雙光子顯微鏡使用長波長脈沖激光，通過物鏡匯聚，由于雙光子激發(fā)需要很高的光子密度，而物鏡焦點(diǎn)處的光子密度是比較高的，所以只有在焦點(diǎn)處才能發(fā)生雙光子激發(fā)，產(chǎn)生熒光，該點(diǎn)產(chǎn)生的熒光再穿過物鏡，被光探頭接收，從而能夠達(dá)到逐點(diǎn)掃描的效果。雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器。美國investigator雙光子顯微鏡成像技術(shù)

雙光子顯微鏡的原理是什么？美國ultima雙光子顯微鏡應(yīng)用是什么

首先我們來簡單介紹一下激光掃描共聚焦和雙光子這兩種當(dāng)紅的顯微成像技術(shù)。激光掃描共聚焦顯微技術(shù)，是熒光顯微成像的一種，用于激發(fā)樣品的熒光信號并對其放大成像。在激光掃描共聚焦顯微鏡中，樣品焦平面上每一時(shí)刻只有一個(gè)點(diǎn)被激發(fā)光照射，縱然焦平面外也有激發(fā)光照射，但通過探測器前的（pinhole），有焦平面上的熒光信號能被探測器接收。也就是說，每個(gè)時(shí)刻，只有焦平面上一個(gè)點(diǎn)的信號被探測。通過點(diǎn)掃描的方式，一個(gè)個(gè)點(diǎn)的信號就可以組合出終的圖像。雙光子顯微鏡（包括多光子顯微鏡）同樣采用點(diǎn)掃描的方式得到圖像。不同的是，其采用的激發(fā)光波長較長，只有當(dāng)兩個(gè)（或更多）激發(fā)光光子幾乎同時(shí)轟擊熒光探針的時(shí)候才可能激發(fā)出熒光信號。所以只有在光子密度特別大的焦點(diǎn)，出才會(huì)激發(fā)出熒光。也就是說，雙光子顯微鏡中，同樣每個(gè)時(shí)刻只有焦平面上一個(gè)點(diǎn)的信號被探測，并且連焦平面外的熒光信號也不會(huì)有。美國ultima雙光子顯微鏡應(yīng)用是什么