隨著技術(shù)的發(fā)展，雙光子顯微鏡的性能不斷優(yōu)化。結(jié)合其特點，大致可以分為兩個方面:深入和主動改進。為了使激發(fā)激光進入更深的層次，可以從器件優(yōu)化和標本改造兩個方面入手。關(guān)于器件的優(yōu)化，我們可以把激光束做得更細，集中能量，讓激光穿透得更深。對于樣品，物質(zhì)的吸收和散射是影響光傳播的主要因素。為了解決這個問題，我們需要將樣本透明化。一種方法是用某種物質(zhì)浸泡標本，使其中的物質(zhì)(主要是脂質(zhì))被破壞或溶解。另一種方法是通過電泳電解脂類，從而提高標本的“透明度”。雙光子顯微鏡角膜成像。國內(nèi)bruker雙光子顯微鏡光毒性
首先我們來簡單介紹一下激光掃描共聚焦和雙光子這兩種當紅的顯微成像技術(shù)。激光掃描共聚焦顯微技術(shù)，是熒光顯微成像的一種，用于激發(fā)樣品的熒光信號并對其放大成像。在激光掃描共聚焦顯微鏡中，樣品焦平面上每一時刻只有一個點被激發(fā)光照射，縱然焦平面外也有激發(fā)光照射，但通過探測器前的（pinhole），有焦平面上的熒光信號能被探測器接收。也就是說，每個時刻，只有焦平面上一個點的信號被探測。通過點掃描的方式，一個個點的信號就可以組合出終的圖像。雙光子顯微鏡（包括多光子顯微鏡）同樣采用點掃描的方式得到圖像。不同的是，其采用的激發(fā)光波長較長，只有當兩個（或更多）激發(fā)光光子幾乎同時轟擊熒光探針的時候才可能激發(fā)出熒光信號。所以只有在光子密度特別大的焦點，出才會激發(fā)出熒光。也就是說，雙光子顯微鏡中，同樣每個時刻只有焦平面上一個點的信號被探測，并且連焦平面外的熒光信號也不會有。ultima2PPLUS雙光子顯微鏡磷光壽命計數(shù)雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖器。
其實電子顯微鏡相比光學(xué)顯微鏡的重要優(yōu)勢或意義不在于放大倍數(shù)，而在于超高的分辨率。這兩者是不同的。一般來說，觀察時，除了放大物體外，還需要將其與其他相鄰物體區(qū)分開來。如果兩個相鄰粒子的圖像在光學(xué)顯微鏡下，即使放大很大程度，也可能看到兩個相交的亮點(艾里斑)，沒有明顯的邊界(更不用說細節(jié)了)，說明分辨率不夠。沒有分辨率談放大是沒有意義的。光學(xué)顯微鏡的分辨率極限是阿貝極限，大約是光波波長的一半。通常稱之為光學(xué)顯微鏡的放大極限，但準確的說應(yīng)該叫分辨率極限。原因是光的衍射，根本原因是光的波粒二象性。電子衍射實驗證明了電子的波動性，所以在電子顯微鏡中用電子代替光是可能的。電子顯微鏡也有很多種，被攝體像REM。也有根據(jù)衍射規(guī)律觀察的電子顯微鏡，如低能電子衍射(LEED)和透射電子顯微鏡(TEM)。兩者主要用于觀察晶體，根據(jù)晶體的周期特性在倒易空間產(chǎn)生衍射像，借助埃爾沃德球或傅里葉變換將其變換到實空間，即可得到真實的晶體表面像。
臨研所、病理科和科研處邀請北京大學(xué)王愛民副教授在2020年12月22日做了題目為“新一代微型雙光子顯微成像系統(tǒng)介紹及其在臨床醫(yī)療診斷”的學(xué)術(shù)報告。學(xué)術(shù)報告由臨研所醫(yī)學(xué)實驗研究平臺潘琳老師主持。王愛民，北京大學(xué)信息科學(xué)技術(shù)學(xué)院副教授，畢業(yè)于北京大學(xué)物理系，獲學(xué)士、碩士學(xué)位，后于英國巴斯大學(xué)物理系獲博士學(xué)位。該研究組研發(fā)的微型雙光子顯微鏡，第1次在國際上獲得了小鼠大腦神經(jīng)元和神經(jīng)突觸清晰穩(wěn)定的動態(tài)信號，該成果獲得了2017年度“中國光學(xué)進展”和“中國科學(xué)進展”，并被NatureMethods評為2018年度“年度方法--無限制行為動物成像”。目前，該研究組正在研究新一代雙光子顯微成像技術(shù)在臨床診斷中的應(yīng)用，為未來即時病理、離體組織檢測、術(shù)中診斷等提供新的影像手段和分析方法。雙光子顯微鏡大量運營在實驗室當中；
雙光子顯微鏡是一種先進的成像技術(shù)，能夠?qū)崿F(xiàn)細胞或組織的深層觀察。它的主要特點是使用雙光子激發(fā)來產(chǎn)生熒光，從而實現(xiàn)對生物樣品的高分辨率成像。雙光子顯微鏡的工作原理是利用激光的脈沖寬度極窄的特性，將高能激光束聚焦到生物樣品中，激發(fā)出熒光。這個過程需要使用一個特殊的雙光子激發(fā)源，它能夠?qū)⒁粋€光子轉(zhuǎn)換為兩個光子，其中一個光子用于激發(fā)熒光，另一個光子則用于成像。雙光子顯微鏡具有以下優(yōu)點：高分辨率：由于雙光子激發(fā)的特性，可以實現(xiàn)對生物樣品的高分辨率成像，特別是對于深層組織的觀察。穿透深度大：雙光子激光的波長較長，能夠更好地穿透生物組織，從而實現(xiàn)對深層細胞的觀察。熒光壽命長：雙光子激發(fā)產(chǎn)生的熒光壽命比單光子激發(fā)產(chǎn)生的熒光壽命長，這使得雙光子顯微鏡能夠更好地區(qū)分不同的熒光標記物。減少光毒性：由于雙光子激發(fā)的能量較低，因此對生物樣品的損傷較小，可以減少光毒性。總之，雙光子顯微鏡是一種非常有用的成像技術(shù)，可以用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、材料科學(xué)等領(lǐng)域的研究。雙光子顯微鏡的探測器,該怎么選用?國外ultima雙光子顯微鏡聯(lián)系方式
雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器。國內(nèi)bruker雙光子顯微鏡光毒性
單光子顯微技術(shù)是成熟的熒光顯微技術(shù)，但由于其使用的激發(fā)光波長較短，成像深度有限；能量較大,會造成對熒光物質(zhì)的漂白,光毒性嚴重。激光共焦掃描顯微鏡由于共焦顯微鏡的孔徑很小,實現(xiàn)樣本三維成像要逐點掃描,成像速度慢,對樣本損害大,很難用于長時間活細胞成像。而寬場顯微鏡能夠很好地實現(xiàn)實時動態(tài)成像,光漂白小,因而較早應(yīng)用于活細胞內(nèi)的實時檢測，但寬場顯微鏡由于離焦信號的干擾,難以實現(xiàn)多維成像。雙光子熒光顯微鏡（Two-PhotonLaser-ScanningMicroscopy）。雙光子顯微成像技術(shù)是近些年發(fā)展起來的結(jié)合了共聚焦激光掃描顯微鏡和雙光子激發(fā)技術(shù)的一種新型非線性光學(xué)成像方法,采用長波激發(fā)，能對組織進行深層次成像。常用的比較好激發(fā)波長大多位于800-900nm，而水、血液和固有組織發(fā)色團對這個波段的光吸收率低，此外散射的激發(fā)光子不能激發(fā)樣品，因此背景第，光損傷小，適用于在體檢測。雙光子熒光成像技術(shù)能準確定位細胞內(nèi)置入的微電極位置，從而觀察胞體、樹突甚至單個樹突棘的活性。研究者可完整的觀察神經(jīng)組織的分辨熒光圖像,甚至可以分辨神經(jīng)細胞單個樹突棘中的鈣分布。國內(nèi)bruker雙光子顯微鏡光毒性
