使用MPM對(duì)神經(jīng)元進(jìn)行成像時(shí)，通過隨機(jī)訪問掃描—即激光束在整個(gè)視場(chǎng)上的任意選定點(diǎn)上進(jìn)行快速掃描—可以只掃描感興趣的神經(jīng)元，這樣不僅避免掃描到任何未標(biāo)記的神經(jīng)纖維，還可以優(yōu)化激光束的掃描時(shí)間。隨機(jī)訪問掃描可以通過聲光偏轉(zhuǎn)器（AOD）來(lái)實(shí)現(xiàn)，其原理是將具有一個(gè)射頻信號(hào)的壓電傳感器粘在合適的晶體上，所產(chǎn)生的聲波引起周期性的折射率光柵，激光束通過光柵時(shí)發(fā)生衍射。通過射頻電信號(hào)調(diào)控聲波的強(qiáng)度和頻率從而可以改變衍射光的強(qiáng)度和方向，這樣使用1個(gè)AOD就可以實(shí)現(xiàn)一維橫向的任意點(diǎn)掃描，利用1對(duì)AOD，結(jié)合其他軸向掃描技術(shù)可實(shí)現(xiàn)3D的隨機(jī)訪問掃描。但是該技術(shù)對(duì)樣本的運(yùn)動(dòng)很敏感，易出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)偽影。目前，快速光柵掃描即在FOV中進(jìn)行逐行掃描，由于利用算法可以輕松解決運(yùn)動(dòng)偽影而被普遍的使用。多光子顯微鏡已經(jīng)被生物學(xué)家普遍的運(yùn)用于實(shí)驗(yàn)中。在體多光子顯微鏡數(shù)據(jù)處理

多束掃描技術(shù)可以同時(shí)對(duì)神經(jīng)元組織的不同位置進(jìn)行成像。該技術(shù):對(duì)于兩個(gè)遠(yuǎn)程成像位置(相距1-2mm以上)，通常采用兩個(gè)**的路徑進(jìn)行成像；對(duì)于相鄰區(qū)域，通常使用單個(gè)物鏡的多個(gè)光束進(jìn)行成像。多光束掃描技術(shù)必須特別注意激發(fā)光束之間的串?dāng)_，這可以通過事后光源分離或時(shí)空復(fù)用來(lái)解決。事后光源分離法是指分離光束以消除串?dāng)_的算法；時(shí)空復(fù)用法是指同時(shí)使用多個(gè)激發(fā)光束，每個(gè)光束的脈沖在時(shí)間上被延遲，使不同光束激發(fā)的單個(gè)熒光信號(hào)可以暫時(shí)分離。引入的光束越多，可以成像的神經(jīng)元越多，但多束會(huì)導(dǎo)致熒光衰減時(shí)間重疊增加，從而限制了分辨信號(hào)源的能力；并且復(fù)用對(duì)電子設(shè)備的工作速度要求很高；大量的光束也需要較高的激光功率來(lái)維持單束的信噪比，這樣容易導(dǎo)致組織損傷。在體多光子顯微鏡數(shù)據(jù)處理多光子顯微鏡之類的先進(jìn)光學(xué)技術(shù)能夠在活生物體的大腦表面下更深地成像。

對(duì)于兩個(gè)遠(yuǎn)距離(相距1-2mm以上)的成像部位，通常采用兩個(gè)**的路徑進(jìn)行成像；對(duì)于相鄰區(qū)域，通常使用單個(gè)物鏡的多個(gè)光束進(jìn)行成像。多光束掃描技術(shù)必須特別注意激發(fā)光束之間的串?dāng)_，這可以通過事后光源分離或時(shí)空復(fù)用來(lái)解決。事后光源分離法是指分離光束以消除串?dāng)_的算法；時(shí)空復(fù)用法是指同時(shí)使用多個(gè)激發(fā)光束，每個(gè)光束的脈沖在時(shí)間上被延遲，使不同光束激發(fā)的單個(gè)熒光信號(hào)可以暫時(shí)分離。引入的光束越多，可以成像的神經(jīng)元越多，但多束會(huì)導(dǎo)致熒光衰減時(shí)間重疊增加，從而限制了分辨信號(hào)源的能力；并且復(fù)用對(duì)電子設(shè)備的工作速度要求很高；大量的光束也需要較高的激光功率來(lái)維持單束的信噪比，這樣容易導(dǎo)致組織損傷。

基于多光子顯微鏡的神經(jīng)成像技術(shù)原理：多光子顯微鏡可用于深度成像和三維成像，因此可用于拍攝不透明的厚樣品。目前主要使用的多光子顯微鏡包括雙光子顯微鏡和三光子顯微鏡。雙光子顯微鏡的結(jié)構(gòu)與共焦類似，區(qū)別在于：1)雙光子顯微鏡的激發(fā)光波長(zhǎng)比共焦長(zhǎng)，能量較低，但穿透能力較強(qiáng)；2)雙光子顯微鏡沒有小孔，提高了檢測(cè)效率；3)雙光子顯微鏡成像深度較快提高。那么，為什么雙光子能具有共焦顯微鏡所沒有的優(yōu)勢(shì)呢？原因是它采用雙光子激發(fā)方式。使用波長(zhǎng)較長(zhǎng)的激發(fā)光子，光子的能量較低，因此電子需要吸收兩個(gè)這樣的激發(fā)光子才能達(dá)到激發(fā)態(tài)，從而釋放出一個(gè)熒光光子。因此，熒光信號(hào)的強(qiáng)度與光強(qiáng)的平方成正比。因?yàn)榻裹c(diǎn)處的光強(qiáng)較大，只能在焦點(diǎn)處激發(fā)熒光。波長(zhǎng)越長(zhǎng)，穿透力越強(qiáng)，因此雙光子顯微鏡的成像深度大于共焦顯微鏡。由于兩個(gè)光子只在焦點(diǎn)激發(fā)熒光，不需要小孔，而是將所有的熒光都收集起來(lái)，提高了檢測(cè)效率。三光子顯微鏡的原理類似于雙光子顯微鏡，利用三個(gè)激發(fā)光子可以實(shí)現(xiàn)更深的成像深度。由于使用了更長(zhǎng)的激發(fā)波長(zhǎng)，穿透能力更強(qiáng)，成像深度更大。此外，由于較強(qiáng)的非線性效應(yīng)，熒光信號(hào)的強(qiáng)度與光強(qiáng)的立方成正比，因此比雙光子具有更低的非聚焦激發(fā)和背景噪聲。多光子顯微鏡將生物打印結(jié)構(gòu)準(zhǔn)確定位和定向到特定的解剖部位，使其能夠在小鼠組織內(nèi)制造復(fù)雜結(jié)構(gòu)。

與傳統(tǒng)的單光子寬視野熒光顯微鏡相比，多光子顯微鏡（MPM）具有光學(xué)切片和深層成像等功能，這兩個(gè)優(yōu)勢(shì)極大地促進(jìn)了研究者們對(duì)于完整大腦深處神經(jīng)的了解與認(rèn)識(shí)。2019年，JeromeLecoq等人從大腦深處的神經(jīng)元成像、大量神經(jīng)元成像、高速神經(jīng)元成像這三個(gè)方面論述了相關(guān)的MPM技術(shù)。想要將神經(jīng)元活動(dòng)與復(fù)雜行為聯(lián)系起來(lái)，通常需要對(duì)大腦皮質(zhì)深層的神經(jīng)元進(jìn)行成像，這就要求MPM具有深層成像的能力。激發(fā)和發(fā)射光會(huì)被生物組織高度散射和吸收是限制MPM成像深度的主要因素，雖然可以通過增加激光強(qiáng)度來(lái)解決散射問題，但這會(huì)帶來(lái)其他問題，例如燒壞樣品、離焦和近表面熒光激發(fā)。增加MPM成像深度比較好的方法是用更長(zhǎng)的波長(zhǎng)作為激發(fā)光。多光子顯微鏡技術(shù)是對(duì)完整組織進(jìn)行深層熒光成像的優(yōu)先技術(shù)。美國(guó)靈長(zhǎng)類多光子顯微鏡成像精度

多光子顯微鏡是一種用于生物學(xué)領(lǐng)域的分析儀器。在體多光子顯微鏡數(shù)據(jù)處理

細(xì)胞在受到外界刺激時(shí)，隨著刺激時(shí)間的增長(zhǎng)，即使刺激繼續(xù)存在，Ca2+熒光信號(hào)不但不會(huì)繼續(xù)增強(qiáng)，反而會(huì)減弱，直至恢復(fù)到未加刺激物時(shí)的水平。對(duì)于細(xì)胞受精過程中Ca2+熒光信號(hào)的變化情況，研究發(fā)現(xiàn)，配了在粘著過程中，Ca2+熒光信號(hào)未發(fā)生任何變化，而配子之間發(fā)生融合作用時(shí)，Ca2+熒光信號(hào)強(qiáng)度卻會(huì)出現(xiàn)一個(gè)不穩(wěn)定的峰值，并可持續(xù)幾分鐘。這些現(xiàn)象，對(duì)研究受精發(fā)育的早期信號(hào)及Ca2+在卵細(xì)胞和受精卵的發(fā)育過程中的作用具有重要的意義。在其它一些生理過程如細(xì)胞分裂、胞吐作用等，Ca2+熒光信號(hào)強(qiáng)度也會(huì)發(fā)生很強(qiáng)的變化。在體多光子顯微鏡數(shù)據(jù)處理