雙光子熒光顯微鏡是結(jié)合了激光掃描共聚焦顯微鏡和雙光子激發(fā)技術(shù)的一種新技術(shù)。雙光子激發(fā)的基本原理是:在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時吸收2個長波長的光子，在經(jīng)過一個很短激發(fā)態(tài)后，發(fā)射出一個波長較短的光子;其效果和使用一個波長為長波長一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的。因其光損傷小、使得觀察熒光細胞成為可能。中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所-雙光子顯微鏡成像平臺借助于雙光子顯微鏡成像技術(shù)及不同轉(zhuǎn)基因小鼠開展對多種臟器的成像研究。以小鼠顱內(nèi)成像為優(yōu)勢，可觀察小鼠顱內(nèi)神經(jīng)細胞、小膠質(zhì)細胞/巨噬細胞、周細胞、血管、轉(zhuǎn)移瘤細胞、膠質(zhì)瘤細胞等的變化情況，在**學、神經(jīng)生物學、發(fā)育生物學、神經(jīng)退行性疾病等領(lǐng)域具有廣泛應用。小鼠其它組織臟器，如脾、顱骨、股骨、胸骨等也可借助本平臺進行成像研究。雙光子顯微鏡為什么穿透能力強?國內(nèi)激光熒光雙光子顯微鏡授權(quán)供應商

通過對顯微光學系統(tǒng)的重新設(shè)計，將FHIRM-TPM2.0的成像視場擴展至420×420平方微米，顯微物鏡的工作距離擴展至1mm，實現(xiàn)無創(chuàng)成像。嵌入可拆卸的快速軸向掃描模塊，實現(xiàn)深度180微米的三維體成像和多平面快速切換的實時成像。該模塊由一個快速電動變焦鏡頭和一對中繼鏡頭組成，在不同深度成像時保持放大率恒定。其中，變焦模塊重1.8克，科研人員可以根據(jù)實驗要求自由拆卸。此外，新型微型成像探頭可以瞬間插拔，極大簡化了實驗操作，避免了長時間實驗對動物的干擾。反復裝卸探針追蹤同批神經(jīng)元時，視場旋轉(zhuǎn)角度小于0.07弧度，邊界偏差小于35微米。美國investigator雙光子顯微鏡授權(quán)商雙光子顯微鏡使用方法是什么？

系統(tǒng)示意圖如圖1所示，紅外激光束從藍寶石激光器出射后，由一個光學參量振蕩器（OPO）轉(zhuǎn)化到可見光波段，產(chǎn)生的可見光脈沖寬度為200fs,重復頻率80MHz，波長在490-750nm范圍內(nèi)可調(diào)諧。光束通過透鏡及平面鏡中繼到包含微透鏡陣列盤和陣列盤的共聚焦掃描單元中，形成用于熒光激發(fā)的多焦點光束。多焦點光束通過一個硅油浸潤的物鏡成像到樣品上，激發(fā)熒光信號。熒光信號由同一個物鏡收集并傳輸?shù)疥嚵袌A盤，產(chǎn)生共焦效應，隔離來自焦平面外的雜散光。

雙光子技術(shù)在醫(yī)學診斷方面有著巨大的應用潛力。這方面沒有標準和體系，需要系統(tǒng)的醫(yī)學研究和龐大的醫(yī)學數(shù)據(jù)支撐。通過基于多光子成像技術(shù)研究細胞結(jié)構(gòu)、生化成分、微環(huán)境、組織形態(tài)、代謝功能的影響信息，可以發(fā)現(xiàn)與細胞學、分子生物學、組織病理學、疾病的診斷和特征的關(guān)系。共同探索生理病理基礎(chǔ)和分子細胞生物學機制，篩選皮膚病、自身免疫性疾病等疑難疾病的識別、診斷和鑒別診斷依據(jù)，建立全新完整的多光子細胞診斷數(shù)據(jù)庫，明確不同疾病的多光子臨床檢測設(shè)備產(chǎn)品標準。在討論環(huán)節(jié)，來自病理科、呼吸中心、心內(nèi)科、神經(jīng)內(nèi)科、皮膚科、研究所的多位醫(yī)生和科研人員結(jié)合各自的工作領(lǐng)域，與王愛民副教授進行了熱烈的討論。其中，毛發(fā)中心楊頂權(quán)主任擬再次邀請王愛民副教授進行學術(shù)交流。通過此次學術(shù)交流，病理學系和研究所分別與王愛民副教授課題組達成了初步合作意向。雙光子顯微鏡在生物醫(yī)學研究中有廣泛的應用，可以觀察細胞內(nèi)的亞細胞結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)分布、細胞活動等。

隨著技術(shù)的發(fā)展，雙光子顯微鏡的性能不斷優(yōu)化。結(jié)合其特點，大致可以分為兩個方面:深入和主動改進。為了使激發(fā)激光進入更深的層次，可以從器件優(yōu)化和標本改造兩個方面入手。關(guān)于器件的優(yōu)化，我們可以把激光束做得更細，集中能量，讓激光穿透得更深。對于樣品，物質(zhì)的吸收和散射是影響光傳播的主要因素。為了解決這個問題，我們需要將樣本透明化。一種方法是用某種物質(zhì)浸泡標本，使其中的物質(zhì)(主要是脂質(zhì))被破壞或溶解。另一種方法是通過電泳電解脂類，從而提高標本的“透明度”。雙光子顯微鏡能夠進行指標成像；美國investigator雙光子顯微鏡授權(quán)商

雙光子顯微鏡的性能得到不斷地優(yōu)化，結(jié)合它的特點，大致可以分成深和活兩個方面的提升。國內(nèi)激光熒光雙光子顯微鏡授權(quán)供應商

WinfriedDenk較初使用的光源是染料飛秒激光器(100fs脈寬、630nm可見光波長)。雖然染料激光器對于實驗室演示尚可，但是使用很不方便所以遠未實現(xiàn)商用。很快雙光子顯微鏡的標配光源就變成了飛秒鈦寶石激光器。除了固態(tài)光源優(yōu)勢，鈦寶石激光器還具有較寬的近紅外波長調(diào)諧范圍，而近紅外相比可見光穿透更深，對生物樣品損傷更小。下圖是Thorlabs的雙光子和三光子顯微鏡配置，鈦寶石飛秒可調(diào)諧激光器位于平臺較左邊。科學家正在從雙光子轉(zhuǎn)向三光子顯微鏡。1996年，ChrisXu在康奈爾大學(Denk同導師實驗室)讀博期間發(fā)明了三光子顯微鏡，如果雙光子吸收可行，那么三光子看起來也是自然的發(fā)展方向。三光子成像使用更長的波長，大約在1.3和1.7微米，其成像深度也比雙光子更深，目前記錄約為2.2毫米，人類大腦皮層厚約4毫米。相比雙光子顯微鏡，三光子還要求以較低重頻使用更強和更短的激光脈沖，而傳統(tǒng)的鈦寶石激光器難以達到這些要求，但是對于摻鐿光纖飛秒光參量放大器則非常容易，比如我們的Y-Fi光參量放大器(OPA)。國內(nèi)激光熒光雙光子顯微鏡授權(quán)供應商