在傳統(tǒng)寬場顯微鏡中，來自標本不同縱深的光線都可投射到同一焦平面（感光元件）上，所以其成像是整個樣品的重疊像，沒有縱向分辨能力。單光子激光共聚焦顯微鏡用針空有效濾除了雜散光，分辨率有了本質(zhì)上的提高，擁有了對樣品的特定焦平面精細成像的能力，可以進行三維成像、動態(tài)成像等。然而，針空在濾除雜散光的同時也將大部分來自焦平面的熒光濾除了，只有很弱的熒光到達檢測器。若要提高信號強度，需要加大激發(fā)光功率，這又會導致對活細胞的光毒性和熒光分子的光漂白增加。雙光子顯微鏡蕞大的優(yōu)勢來源于其雙光子光源的非線性光學效應(yīng)，與單光子共聚焦顯微鏡蕞大的不同在于無須使用針空限制光學散射，其具體優(yōu)勢如下所述。在深度組織中以較長時間對細胞成像，雙光子顯微鏡是當前之選。熒光雙光子顯微鏡分辨率
隨著技術(shù)的發(fā)展，雙光子顯微鏡的性能得到不斷地優(yōu)化，結(jié)合它的特點，大致可以分成深和活兩個方面的提升。要想讓激發(fā)激光進入更深的層面，大致可從兩個方面入手，裝置優(yōu)化與標本改造。關(guān)于裝置優(yōu)化，我們可以把激光束變得更細，使能量更加集中，就能讓激光穿透更深。關(guān)于標本，其中影響光傳播的主要是物質(zhì)吸收和散射，解決這個問題，我們需要對樣本進行透明化處理。一種方法是運用某種物質(zhì)將標本浸泡，使其中的物質(zhì)（主要是脂質(zhì)）被破壞或溶解。另一種方法是運用電泳將脂質(zhì)電解，進而讓標本“透明度”提高。進口雙光子顯微鏡成像技術(shù)雙光子顯微鏡能夠在細胞甚至是亞細胞水平上對神經(jīng)細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)、離子濃度、細胞運動、進行直接成像監(jiān)測。
雙光子顯微成像技術(shù)不是什么新技術(shù)，早在20多年前就有了，目前已經(jīng)在生命科學和材料科學中廣泛應(yīng)用。幾年前雙光子**過期后，已經(jīng)推出自己的雙光子顯微鏡的廠家估計不少于10家以上。即便如此，世界上很多實驗室都搭雙光子，自己搭的好處有很多，首先是便宜，尤其是實驗室已經(jīng)有飛秒激光器，那就更很省錢了。其次是靈活，可以選擇針對特殊用途的搭配，改動也靈活。結(jié)束后的好處就是可以鍛煉隊伍，一趟走下來可以把新手帶出來，后期維護也更加自由。當然壞處也不少，首先是操心，特別是第1次搭的時候，開始要想方案，后來要解決各種實際問題。其次是花時間，加上買配件的時間，比買一臺現(xiàn)成的商業(yè)化雙光子耗時長?，F(xiàn)在已經(jīng)有不少關(guān)于如何搭雙光子顯微鏡的文章，各種protocol，大多是老外寫的，中文的較少。其實完全自己搭一套好用的系統(tǒng)還是不容易的，尤其是沒有經(jīng)驗的時候，容易走彎路，多花錢，也多花時間，再加上雙光子的重要器件都需要從國外購買，在國內(nèi)買這些東西耗時較長。因此，我想總結(jié)一下我們的經(jīng)驗，貼出來分享，希望能幫到想自己動手的實驗室
許多生物醫(yī)學成像方式，無論是單光子(共聚焦)或多光子(雙光子)，都使用激光作為光源，并需要兼容的熒光染料。熒光染料有自己的激發(fā)波長，它們可以被單個光子以該激發(fā)波長的光子能量激發(fā)(E=hv=h*c/λ);或者是兩個幾乎同時到達的光子，但每個光子的能量約為單光子能量的一半，即雙波長(0.5E->2λ)。前者是單光子顯微鏡原理，后者是雙光子顯微鏡原理。在對同一種熒光染料進行成像時，雙光子與單光子相比可以使用約兩倍波長，因此雙光子的散射較小(波長較長，散射較小)，可以更深入地滲透到組織中。雙光子顯微鏡已延伸到各個領(lǐng)域研究中，它能對樣品進行三維觀察。
在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時吸收兩個長波長的光子，然后發(fā)射出一個波長較短的光子，其效果和使用一個波長為長波長一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的如煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH），在單光子激發(fā)時，在波長為350nm光的激發(fā)下發(fā)出450nm熒光；而在雙光子激發(fā)時，可采用700nm的激發(fā)光得到450nm熒光。由于雙光子激發(fā)需要很高的光子密度，為了不損傷細胞，雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器。這種激光器發(fā)出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，從而可以減少光漂白和光毒性帶來的不利影響。雙光子顯微鏡在組織透明化成像中應(yīng)用。激光熒光雙光子顯微鏡供應(yīng)商聯(lián)系方式
雙光子顯微鏡供應(yīng)商找因斯蔻浦(上海)生物科技有限公司。熒光雙光子顯微鏡分辨率
而配合了雙光子激發(fā)技術(shù)，激光共聚掃描顯微鏡則能更好得發(fā)揮功效。那么，什么是雙光子激發(fā)技術(shù)呢？在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時吸收2個長波長的光子使電子躍遷到較高能級，經(jīng)過一個很短的時間后，電子再躍遷回低能級同時放出一個波長為長波長一半的光子（P=h/λ）。利用這個原理，便誕生了雙光子激發(fā)技術(shù)。雙光子顯微鏡使用長波長脈沖激光，通過物鏡匯聚，由于雙光子激發(fā)需要很高的光子密度，而物鏡焦點處的光子密度是比較高的，所以只有在焦點處才能發(fā)生雙光子激發(fā)，產(chǎn)生熒光，該點產(chǎn)生的熒光再穿過物鏡，被光探頭接收，從而達到逐點掃描的效果。熒光雙光子顯微鏡分辨率
