2020年，臨研所、病理科和科研處邀請北京大學王愛民副教授做了題目為“新一代微型雙光子顯微成像系統(tǒng)介紹及其在臨床醫(yī)療診斷”的學術報告。學術報告由臨研所醫(yī)學實驗研究平臺潘琳老師主持。王愛民，北京大學信息科學技術學院副教授，畢業(yè)于北京大學物理系，獲學士、碩士學位，后于英國巴斯大學物理系獲博士學位。該研究組研發(fā)的微型雙光子顯微鏡，第1次在國際上獲得了小鼠大腦神經(jīng)元和神經(jīng)突觸清晰穩(wěn)定的動態(tài)信號，該成果獲得了2017年度“中國光學進展”和“中國科學進展”，并被NatureMethods評為2018年度“年度方法--無限制行為動物成像”。目前，該研究組正在研究新一代雙光子顯微成像技術在臨床診斷中的應用，為未來即時病理、離體組織檢測、術中診斷等提供新的影像手段和分析方法。雙光子顯微鏡結合了雙光子激發(fā)技術和激光掃描共聚顯微鏡。布魯克雙光子顯微鏡用途

雙光子熒光顯微鏡是結合了激光掃描共聚焦顯微鏡和雙光子激發(fā)技術的一種新技術。雙光子激發(fā)的基本原理是：在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時吸收2個長波長的光子，在經(jīng)過一個很短的所謂激發(fā)態(tài)壽命的時間后，發(fā)射出一個波長較短的光子；其效果和使用一個波長為長波長一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的。雙（多）光子成像優(yōu)勢在于，具有更深的組織穿透深度，利用紅外光，能夠在層面檢測極限達1mm的組織區(qū)域；因信號背景比高，而具有更高的對比度；因激發(fā)體積小，具有定點激發(fā)的特性，具有更少的光毒性；激發(fā)波長由紫外、可見光調整為紅外激發(fā)，使其能夠更加安全。進口激光雙光子顯微鏡供應商雙光子顯微鏡不需要共聚焦細孔，提高了熒光檢測效率。

TOPTICAFemtoFiberultra920超快光纖激光器是一種易于操作和免維護的激光系統(tǒng)其輸出波長為920nm，非常適合常規(guī)熒光基團(如GFP、eGFP、曙紅、GCaMP、CFP、鈣黃綠素或金星)的雙光子激發(fā)。它可以為熒光基團提供相對較高的峰值功率，常用于神經(jīng)科學和其他與激光相關的光子學。此外，其獨特的設計(簡單和經(jīng)濟的光源)具有創(chuàng)新雙光子熒光顯微鏡發(fā)展的潛力。在雙光子顯微鏡中，峰值功率就是亮度！如果你想獲得更好的圖像亮度，那么你需要短脈沖，高功率，更重要的是，干凈的時間脈沖形狀。FemtoFiberultra920具有足夠高的輸出功率、短脈沖、獨特的Clean-Pulse技術和相對較高的峰值功率，這使得在雙光子顯微鏡中實現(xiàn)****亮度而無需對樣品進行不必要的加熱成為可能。FemtoFiberultra920全包式、完全集成的色散補償(可確保樣品處的短脈沖)、內置電源控制、直觀的操作及其堅固緊湊的設計使系統(tǒng)具有非常友好的用戶體驗，是非線性顯微鏡應用的良好解決方案。例如，熒光蛋白的雙光子激發(fā)和基于SHG的對比機制

利用鈣成像技術記錄大腦活動，隨著功能光學成像技術的發(fā)展，神經(jīng)學家們已經(jīng)可以研究腦區(qū)和神經(jīng)元內部的工作情況。功能鈣成像技術就是其中之一，其主要原理是將外源性熒光信號和生理現(xiàn)象耦合起來——通過熒光染料信號的改變反映細胞內游離鈣離子濃度，以此細胞的功能狀態(tài)。目前它被廣泛應用于實時監(jiān)測一群相關神經(jīng)元內鈣離子的變化，從而判斷其功能活動。該技術的出現(xiàn)使得科學家可以親眼目睹神經(jīng)信號在神經(jīng)網(wǎng)絡之中時間和空間上的傳遞穿梭。雙光子顯微鏡是新型的熒光顯微鏡，其原理大致是這樣的；

雙光子顯微成像技術不是什么新技術，早在20多年前就有了，目前已經(jīng)在生命科學和材料科學中廣泛應用。幾年前雙光子**過期后，已經(jīng)推出自己的雙光子顯微鏡的廠家估計不少于10家以上。即便如此，世界上很多實驗室都搭雙光子，自己搭的好處有很多，首先是便宜，尤其是實驗室已經(jīng)有飛秒激光器，那就更很省錢了。其次是靈活，可以選擇針對特殊用途的搭配，改動也靈活。結束后的好處就是可以鍛煉隊伍，一趟走下來可以把新手帶出來，后期維護也更加自由。當然壞處也不少，首先是操心，特別是第1次搭的時候，開始要想方案，后來要解決各種實際問題。其次是花時間，加上買配件的時間，比買一臺現(xiàn)成的商業(yè)化雙光子耗時長?，F(xiàn)在已經(jīng)有不少關于如何搭雙光子顯微鏡的文章，各種protocol，大多是老外寫的，中文的較少。其實完全自己搭一套好用的系統(tǒng)還是不容易的，尤其是沒有經(jīng)驗的時候，容易走彎路，多花錢，也多花時間，再加上雙光子的重要器件都需要從國外購買，在國內買這些東西耗時較長。因此，我想總結一下我們的經(jīng)驗，貼出來分享，希望能幫到想自己動手的實驗室雙光子顯微鏡使用方法是什么？美國ultima2PPLUS雙光子顯微鏡的成像視野

優(yōu)勢來源于其雙光子光源的非線性光學效應。布魯克雙光子顯微鏡用途

隨著技術的發(fā)展，雙光子顯微鏡的性能不斷優(yōu)化。結合其特點，大致可以分為兩個方面:深入和主動改進。為了使激發(fā)激光進入更深的層次，可以從器件優(yōu)化和標本改造兩個方面入手。關于器件的優(yōu)化，我們可以把激光束做得更細，集中能量，讓激光穿透得更深。對于樣品，物質的吸收和散射是影響光傳播的主要因素。為了解決這個問題，我們需要將樣本透明化。一種方法是用某種物質浸泡標本，使其中的物質(主要是脂質)被破壞或溶解。另一種方法是通過電泳電解脂類，從而提高標本的“透明度”。布魯克雙光子顯微鏡用途