后續(xù)實驗使用碘化丙啶(PI)來指示細胞在7、8、9和10分鐘的延時觀察后的損傷情況，來驗證該光學(xué)系統(tǒng)對活細胞長期觀察的適用性。在觀察期間，88個焦點以100毫秒的曝光時間，曝光間隔1s照射樣品，激發(fā)強度為3.21×104W/cm2，激發(fā)波長為525nm，使用前文提到的60×物鏡及1.0AU孔徑，圖5(a)-(d)為引入PI的成像圖，(e)-(h)為相應(yīng)的相應(yīng)襯度圖。改變激發(fā)條件為每照射500ms間隔5s，得到相應(yīng)的(i)-(p)。由圖像可知，延時觀察小于8分鐘的情況下不造成可見細胞損傷，對于實際3D延時成像，由于焦平面是移動的，所以預(yù)期細胞存活時間會更長，可見這是一種在3D在體延時成像中具有很大優(yōu)勢的成像方案。在深度組織中以較長時間對細胞成像，雙光子顯微鏡是當(dāng)前之選。進口布魯克雙光子顯微鏡光刺激

2008年錢永健等人由于熒光蛋白（GFP，綠色熒光蛋白）的發(fā)現(xiàn)和使用，獲得了諾貝爾化學(xué)獎，是對熒光成像技術(shù)的一次巨大肯定和推動。光學(xué)成像本身具有高分辨率、高通量、非侵入和非毒性等特點，再與熒光蛋白以及熒光染料等標記物在細胞中的定位與表達技術(shù)相結(jié)合，使得科學(xué)家可以特異性的分辨生物體乃至細胞內(nèi)部不同結(jié)構(gòu)與成分，并且能夠在生命體和細胞仍具有活性的狀態(tài)下（狀態(tài)）對其功能進行動態(tài)觀察。這就使得熒光成像技術(shù)成為了無可替代的，生物學(xué)家現(xiàn)今較為重要的技術(shù)手段之一。目前，大多數(shù)細胞生物學(xué)和生理學(xué)研究主要還是在離體培養(yǎng)的細胞體系中研究。然而與細胞生物學(xué)研究有所不同的是，大腦的功能研究的整體性和原位性顯得更加關(guān)鍵：只研究分離的神經(jīng)元無法解釋神經(jīng)系統(tǒng)的功能和規(guī)律。由于被觀測的信號會受到樣本組織的散射和吸收，根本無法穿透如此深的組織進行成像。而雙光子顯微鏡（Two-photonMicroscopy，簡稱TPM）的發(fā)明，則為此類研究帶來了希望。雙光子顯微鏡特有的非線性光學(xué)特性，再加上其工作波長處在紅外區(qū)域等特點，令其在生物體組織內(nèi)的穿透深度較大提高，使得雙光子顯微鏡成為神經(jīng)科學(xué)家進行神經(jīng)成像較理想的工具。進口布魯克雙光子顯微鏡光刺激雙光子顯微鏡在組織透明化成像中應(yīng)用；

雙光子熒光顯微鏡是結(jié)合了激光掃描共聚焦顯微鏡和雙光子激發(fā)技術(shù)的一種新技術(shù)。雙光子激發(fā)的基本原理是:在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時吸收2個長波長的光子，在經(jīng)過一個很短激發(fā)態(tài)后，發(fā)射出一個波長較短的光子;其效果和使用一個波長為長波長一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的。因其光損傷小、樣本透射深等優(yōu)勢，使得觀察熒光細胞成為可能。中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所-雙光子顯微鏡成像平臺借助于雙光子顯微鏡成像技術(shù)及不同轉(zhuǎn)基因小鼠開展對多種臟器的***成像研究。以小鼠顱內(nèi)***成像為優(yōu)勢，可動態(tài)**觀察小鼠顱內(nèi)神經(jīng)細胞、小膠質(zhì)細胞/巨噬細胞、周細胞、血管、轉(zhuǎn)移瘤細胞、膠質(zhì)瘤細胞等的變化情況，在**學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、神經(jīng)退行性疾病等領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用。小鼠其它組織臟器，如脾、肺、顱骨、股骨、胸骨等也可借助本平臺進行成像研究。

雙光子顯微成像技術(shù)不是什么新技術(shù)，早在20多年前就有了，目前已經(jīng)在生命科學(xué)和材料科學(xué)中廣泛應(yīng)用。幾年前雙光子**過期后，已經(jīng)推出自己的雙光子顯微鏡的廠家估計不少于10家以上。即便如此，世界上很多實驗室都搭雙光子，自己搭的好處有很多，首先是便宜，尤其是實驗室已經(jīng)有飛秒激光器，那就更很省錢了。其次是靈活，可以選擇針對特殊用途的搭配，改動也靈活。結(jié)束后的好處就是可以鍛煉隊伍，一趟走下來可以把新手帶出來，后期維護也更加自由。當(dāng)然壞處也不少，首先是操心，特別是第1次搭的時候，開始要想方案，后來要解決各種實際問題。其次是花時間，加上買配件的時間，比買一臺現(xiàn)成的商業(yè)化雙光子耗時長?，F(xiàn)在已經(jīng)有不少關(guān)于如何搭雙光子顯微鏡的文章，各種protocol，大多是老外寫的，中文的較少。其實完全自己搭一套好用的系統(tǒng)還是不容易的，尤其是沒有經(jīng)驗的時候，容易走彎路，多花錢，也多花時間，再加上雙光子的重要器件都需要從國外購買，在國內(nèi)買這些東西耗時較長。因此，我想總結(jié)一下我們的經(jīng)驗，貼出來分享，希望能幫到想自己動手的實驗室雙光子顯微鏡可以進行厚的組織樣品拍攝。

美國霍華德·休斯醫(yī)學(xué)研究所在Janelia Farm ResearchCampus的吉娜博士小組與來自中科院上海光機所強場激光物理國家重點實驗室的王琛博士較近成功將一種新的自適應(yīng)光學(xué)的方法和雙光子顯微鏡結(jié)合，研制出一種新的自適應(yīng)光學(xué)雙光子熒光顯微鏡。通過校正小鼠大腦的像差，在視覺皮層的不同深度處均獲得了提高數(shù)倍的成像分辨率和信號強度，明顯改進了成像質(zhì)量，使得原來在鼠腦中不可見或者模糊的細節(jié)變得清晰可見，她們成功將該方法應(yīng)用于老鼠視覺皮層第五層（約500μm）的形貌結(jié)構(gòu)成像和鈣離子功能成像。這一新的自適應(yīng)光學(xué)方法，使得在小鼠深層區(qū)域成像中獲得近衍射極限的成像分辨率成為現(xiàn)實。這一成果發(fā)表在較新一期的《Nature Methods》。由于雙光子顯微鏡使用的是可見光或近紅外光作為激發(fā)光源，適用于長時間的研究。進口investigator雙光子顯微鏡應(yīng)用是什么

雙光子顯微鏡角膜成像。進口布魯克雙光子顯微鏡光刺激

新一代微型化雙光子熒光顯微鏡體積小，重只2.2克，適于佩戴在小動物頭部顱窗上，實時記錄數(shù)十個神經(jīng)元、上千個神經(jīng)突觸的動態(tài)信號。在大型動物上，還可望實現(xiàn)多探頭佩戴、多顱窗不同腦區(qū)的長時程觀測。相比單光子激發(fā)，雙光子激發(fā)具有良好的光學(xué)斷層、更深的生物組織穿透等優(yōu)勢，其橫向分辨率達到0.65μm，成像質(zhì)量與商品化大型臺式雙光子熒光顯微鏡可相媲美，遠優(yōu)于目前領(lǐng)域內(nèi)主導(dǎo)的、美國腦科學(xué)計劃重要團隊所研發(fā)的微型化寬場顯微鏡。采用雙軸對稱高速微機電系統(tǒng)轉(zhuǎn)鏡掃描技術(shù)，成像幀頻已達40Hz（256*256像素），同時具備多區(qū)域隨機掃描和每秒1萬線的線掃描能力。此外，采用自主設(shè)計可傳導(dǎo)920nm飛秒激光的光子晶體光纖，該系統(tǒng)實現(xiàn)了微型雙光子顯微鏡對腦科學(xué)領(lǐng)域較廣泛應(yīng)用的指示神經(jīng)元活動的熒光探針（如GCaMP6）的有效利用。 同時采用柔性光纖束進行熒光信號的接收，解決了動物的活動和行為由于熒光傳輸光纜拖拽而受到干擾的難題。未來，與光遺傳學(xué)技術(shù)的結(jié)合，可望在結(jié)構(gòu)與功能成像的同時，精細地操控神經(jīng)元和神經(jīng)回路的活動。進口布魯克雙光子顯微鏡光刺激

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