使用基因編碼的熒光探針可以在突觸和細(xì)胞分辨率下監(jiān)測體內(nèi)神經(jīng)元信號，這是揭示動物神經(jīng)活動復(fù)雜機(jī)制的關(guān)鍵。使用雙光子顯微鏡（2PM）可以以亞細(xì)胞分辨率對鈣離子傳感器和谷氨酸傳感器成像，從而測量不透明大腦深處的活動；成像膜電壓變化能直接反映神經(jīng)元活動，但神經(jīng)元活動的速度對于常規(guī)的2PM來說太快。目前電壓成像主要通過寬場顯微鏡實現(xiàn)，但它的空間分辨率較差并且于淺層深度。因此要在不透明的大腦中以高空間分辨率對膜電壓變化進(jìn)行成像，需要明顯提高2PM的成像速率。多光子顯微鏡，實現(xiàn)無創(chuàng)、實時、動態(tài)的生物組織觀測。共聚焦多光子顯微鏡峰值功率密度

ＳｔｅｒｎａｎｄＪｅａｎＭａｒｘ在評論中說：祖家能夠在更為精細(xì)的層次研究樹突的功能，這在以前是完全不可能的。新的技術(shù)（如腦片的膜片鉗和雙光子顯微使人們對樹突的計算和神經(jīng)信號處理中的作用有了更好的理解。他們解釋了是樹突模式和形狀多樣性，及其獨特的電、及其獨特的電化學(xué)特征使神經(jīng)元完成了一系列的專門任務(wù)。雙光子與共聚焦在發(fā)育生物學(xué)中的應(yīng)用雙光子∶每2.5分鐘掃描一次，觀察24小時，發(fā)育到桑椹胚和胚泡階段共聚焦∶每15分鐘掃描一次，觀察8小時后細(xì)胞分裂停止，不能發(fā)育到桑椹胚和胚泡階段共聚焦激發(fā)時的細(xì)胞存活率為多光子系統(tǒng)的10～20%。美國靈長類多光子顯微鏡暗場成像多光子顯微鏡的分辨率比傳統(tǒng)的單光子共聚焦要低的多。

快速光柵掃描有多種實現(xiàn)方式，使用振鏡進(jìn)行快速2D掃描，將振鏡和可調(diào)電動透鏡結(jié)合在一起進(jìn)行快速3D掃描，但可調(diào)電動透鏡由于機(jī)械慣性的限制在軸向無法快速進(jìn)行焦點切換，影響成像速度，現(xiàn)可使用空間光調(diào)制器（SLM）代替。遠(yuǎn)程聚焦也是一種實現(xiàn)3D成像的手段，如圖2所示。在LSU模塊中，掃描振鏡進(jìn)行橫向掃描，ASU模塊包括物鏡L1和反射鏡M，通過調(diào)控M的位置實現(xiàn)軸向掃描。該技術(shù)不僅可以校正主物鏡L2引入的光學(xué)像差，還可以進(jìn)行快速的軸向掃描。想要獲得更多神經(jīng)元成像，可以通過調(diào)整顯微鏡的物鏡設(shè)計來擴(kuò)大FOV，但是具有大NA和大FOV的物鏡通常重量較大，無法快速移動以進(jìn)行快速軸向掃描，因此大型FOV系統(tǒng)依賴于遠(yuǎn)程聚焦、SLM和可調(diào)電動透鏡。

當(dāng)細(xì)胞在受到外界刺激時，隨著刺激時間的增長，即使刺激繼續(xù)存在，Ca2+熒光信號不但不會繼續(xù)增強(qiáng)，反而會減弱，直至恢復(fù)到未加刺激物時的水平。對于細(xì)胞受精過程中Ca2+熒光信號的變化情況，研究發(fā)現(xiàn)，配了在粘著過程中，Ca2+熒光信號未發(fā)生任何變化，而配子之間發(fā)生融合作用時，Ca2+熒光信號強(qiáng)度卻會出現(xiàn)一個不穩(wěn)定的峰值，并可持續(xù)幾分鐘。這些現(xiàn)象，對研究受精發(fā)育的早期信號及Ca2+在卵細(xì)胞和受精卵的發(fā)育過程中的作用具有重要的意義。在其它一些生理過程如細(xì)胞分裂、胞吐作用等，Ca2+熒光信號強(qiáng)度也會發(fā)生很的變化。多光子顯微鏡銷售渠道分析及建議。

對于雙光子（2P）成像而言，離焦和近表面熒光激發(fā)是兩個比較大的深度限制因素，而對于三光子（3P）成像這兩個問題大大減小，但是三光子成像由于熒光團(tuán)的吸收截面比2P要小得多，所以需要更高數(shù)量級的脈沖能量才能獲得與2P激發(fā)的相同強(qiáng)度的熒光信號。功能性3P顯微鏡比結(jié)構(gòu)性3P顯微鏡的要求更高，它需要更快速的掃描，以便及時采樣神經(jīng)元活動；需要更高的脈沖能量，以便在每個像素停留時間內(nèi)收集足夠的信號。復(fù)雜的行為通常涉及到大型的大腦神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)既具有局部的連接又具有遠(yuǎn)程的連接。要想將神經(jīng)元活動與行為聯(lián)系起來，需要同時監(jiān)控非常龐大且分布普遍的神經(jīng)元的活動，大腦中的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)會在幾十毫秒內(nèi)處理傳入的刺激，要想了解這種快速的神經(jīng)元動力學(xué)，就需要MPM具備對神經(jīng)元進(jìn)行快速成像的能力?？焖費PM方法可分為單束掃描技術(shù)和多束掃描技術(shù)。多光子顯微鏡，實現(xiàn)無創(chuàng)、無標(biāo)記的生物組織觀測方案。美國布魯克多光子顯微鏡飛秒激光

顯微鏡簡史：從光到多光子顯微鏡。共聚焦多光子顯微鏡峰值功率密度

對于兩個遠(yuǎn)距離(相距1-2mm以上)的成像部位，通常采用兩個**的路徑進(jìn)行成像；對于相鄰區(qū)域，通常使用單個物鏡的多個光束進(jìn)行成像。多光束掃描技術(shù)必須特別注意激發(fā)光束之間的串?dāng)_，這可以通過事后光源分離或時空復(fù)用來解決。事后光源分離法是指分離光束以消除串?dāng)_的算法；時空復(fù)用法是指同時使用多個激發(fā)光束，每個光束的脈沖在時間上被延遲，使不同光束激發(fā)的單個熒光信號可以暫時分離。引入的光束越多，可以成像的神經(jīng)元越多，但多束會導(dǎo)致熒光衰減時間重疊增加，從而限制了分辨信號源的能力；并且復(fù)用對電子設(shè)備的工作速度要求很高；大量的光束也需要較高的激光功率來維持單束的信噪比，這樣容易導(dǎo)致組織損傷。共聚焦多光子顯微鏡峰值功率密度