大規(guī)模生產(chǎn)階段，AAV/LV載體生產(chǎn)流程跟抗體、疫苗類藥物的生產(chǎn)類似，主要包含上游培養(yǎng)、下游純化及制劑部分。上游培養(yǎng)分為質(zhì)粒開發(fā)、細(xì)胞擴(kuò)增、三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染及病毒載體生產(chǎn)等步驟。下游純化分為細(xì)胞裂解釋放AAV病毒顆粒（可以通過去污劑、機(jī)械作用、高滲或凍融操作等）or收獲細(xì)胞上清液得到含LV病毒原液、加入核酸酶以減少宿主細(xì)胞核酸污染、澄清是通過離心或過濾等方法去除細(xì)胞碎片和雜質(zhì)等、超濾濃縮以減少后續(xù)色譜純化體系、親合及離子交換等純化得到高純度病毒載體。制劑部分主要是超濾更換緩沖液、過濾除菌及制劑灌裝等。SAN HQ高鹽核酸酶具有熱不穩(wěn)定的特性，在還原劑存在條件下，50℃、30min孵育即可失活；浙江ArcticZymes高鹽核酸酶70921-160
一般來說，生物生產(chǎn)工藝用的核酸酶以BenzonaseTM（BenzonaseTM是Merck的注冊商標(biāo)）為主，能高效降解任何形式（雙鏈、單鏈、線狀、環(huán)狀）的DNA和RNA。該酶來自于大自然界普遍存在的S.Marcescen，通過E.coli發(fā)酵生產(chǎn)得到。該酶的適宜反應(yīng)條件是低鹽濃度范圍（<100mM鹽濃度），且酶活隨著鹽濃度上升而下降，在300mM鹽濃度時酶活幾乎喪失。對于細(xì)胞基因藥物常用的兩種病毒載體LV和AAV，LV由于含有脂包膜結(jié)構(gòu)一般都在生理鹽條件下存在，而AAV在高鹽條件下不易團(tuán)聚、更穩(wěn)定。而在生理鹽濃度及更高濃度條件下，Benzonase活性受到抑制。天津高鹽核酸酶70921-202鑒于其在高鹽條件下的較高活性，SAN HQ高鹽核酸酶在不損失載體產(chǎn)量和活性的情況下改善了下游工藝。
氯化銫(CsCl)/碘克沙醇密度梯度離心大概是經(jīng)典的AAV純化技術(shù)了。這種技術(shù)適用于所有血清型且分辨率高，但是因生產(chǎn)工藝很難放大，低通量等缺點阻礙了其在工業(yè)中的應(yīng)用。繼密度梯度離心之后，色譜法不斷發(fā)展，并逐漸成為一種成熟的、主流的方法。色譜法通過載體的凈電荷、疏水性、對配體的親和性、大小以及其他性質(zhì)來分離并純化載體。這類技術(shù)有諸多的優(yōu)點：更具可擴(kuò)展性和成本效益，可多次重復(fù)使用，可并行運行或串聯(lián)運行，還可有效去除非定植劑，這是開發(fā)后期的一個關(guān)鍵方面。
染色質(zhì)由組蛋白和DNA組成，——147個堿基對的DNA纏繞在8個組蛋白（由H2A、H2B、H3和H4形成的八聚體）周圍，形成基本的染色質(zhì)單位，即核小體。核小體像珠串一樣串連在一起，并被包裝成更高階的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)。DNA帶負(fù)電荷，富含堿性氨基酸的組蛋白帶正電荷，且組蛋白多聚物有很多疏水區(qū)段。所有這些特點導(dǎo)致宿主DNA殘留（HCD）能吸附很多物質(zhì)，包括宿主蛋白殘留（HCD）、色譜填料、目的病毒顆粒等，因此，HCD的存在增加了工藝流程的復(fù)雜度，同時也降低了病毒顆粒的穩(wěn)定性。SAN HQ高鹽核酸酶在鹽濃度400-650mM條件下活性達(dá)到峰值。
在生物工藝中，核酸酶的主要作用是高效消化宿主細(xì)胞DNA（HCD），并將其分解成足夠小的片段，以便在下游純化過程中去除。雖然大多數(shù)核酸酶可以在生理鹽條件下高效地將裸DNA降解成微小片段，比如Benzonase和SANs都可以把dsDNA分解成小于8nt的寡核苷酸鏈，但實際生產(chǎn)中的核酸污染情況更加復(fù)雜。HCD通常以染色質(zhì)形式存在，與細(xì)胞裂解碎片、病毒顆粒等結(jié)合在一起，影響核酸酶的識別及剪切。因此，HCD去除的關(guān)鍵在于——核酸酶如何在復(fù)雜的生產(chǎn)體系中識別并剪切HCD。在AAV生產(chǎn)過程中使用SAN HQ高鹽核酸酶。河南500mM鹽濃度條件高鹽核酸酶70921
高鹽濃度下，宿主DNA與蛋白質(zhì)能夠更高效解離，從而更容易被降解。浙江ArcticZymes高鹽核酸酶70921-160
?通過三質(zhì)粒瞬轉(zhuǎn)體系生產(chǎn)病毒載體，會引入宿主細(xì)胞DNA殘留（HCD）、蛋白殘留（HCP）、工藝雜質(zhì)（如antibiotics、核酸酶等外源物質(zhì)）等污染，存在潛在的致瘤性和免疫原性等風(fēng)險。藥品監(jiān)管機(jī)構(gòu)一般允許生物制品中存在10ng/dose以下的殘留DNA。此外，根據(jù)雜質(zhì)來源、工藝以及產(chǎn)品類型不同，也會對HCD限度做不同要求。為了達(dá)到這個要求，一般通過核酸酶處理和色譜聯(lián)用的方法。一般在細(xì)胞培養(yǎng)液裂解/收獲、澄清收獲及超濾濃縮等環(huán)節(jié)加入核酸酶處理，需要工藝摸索來確認(rèn)處理方式。浙江ArcticZymes高鹽核酸酶70921-160
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